2 курс / Гистология / Методы_контрастирования_в_микроскопии_Колтовой_Н_А_Краевой_С_А_

-Программа Helios Focus - программа для обработки фотографий, которая создает одно полностью сфокусированное изображение из нескольких частично сфокусированных изображений, решая при этом проблему глубины резкости.

Например, в моторизированном микроскопе Olympus BX63 весь процесс получения снимка моторизирован – управление смещением столика и камерой осуществляется с помощью программы управления комплексом.

Режим расширенной глубины резкости так же может быть использован для построения рельефа поверхности.

-Чмыхов Дмитрий Владимирович. Моделирование процесса объемной реконструкции исследуемой поверхности при компьютерной микроскопии. Диссертация кандидата технических наук. Брянск. 2009. 159 с.

-Игнатенко А.В. Реконструкция плоских объектов по изображениям с микроскопа. Программные продукты и системы. 2009. №3.

3.3.6 Мультиспектральная обработка изображений.

На предварительном этапе производится ввод изображения объекта в различных спектральных диапазонах. Затем на основе совместной обработки этих изображений синтезируется результирующее высококонтрастное изображение объекта. Для обработки мультиспектральных изображений необходимы специальные методы обработки мультиспектральных изображений. Ранее такие методы применялись при обработке мультиспектральных космических снимков. Промоделировать обработку мультиспектральных данных можно с помощью программы Photoshop, которая может работать с тремя каналами. Каждое цветное изображение состоит из трех монохромных изображений (каналов) – красный, зеленый, синий. При обработке изображений операции применяются одновременно ко всем трем каналам. Но с помощью функции Изображение – Регулировка – Уровни можно корректировать каждый канал независимо. Отдельно каналы можно просмотреть с помощью функции Окно – Каналы. Можно каждый канал скопировать в отдельное изображение и обрабатывать независимо от других каналов.

Один из методов обработки состоит в вычисления разности между изображениями, полученными в различных спектральных диапазонах. В программе Photoshop получить разностное изображение между каналами можно с помощью функции Изображение – Вычисления.

Заметим, что объекта может быть не видно ни на одном из мультиспектральных снимков. Но так как объект и среда имеют различные спектры поглощения, то при работе с разностными изображениями можно получить высокий контраст объекта.

71

3.4 Контрастирование при отображения полученных изображений

3.4.1 Аппаратное контрастирование при отображении.

Аппаратное контрастирование при отображении осуществляется регулировкой яркости и контрастности в устройстве отображения – в дисплее компьютера.

3.4.2 Псевдоцвет (pseudocolor), цветовое кодирование.

Одним из методов для выявления слабоконтрастных областей на черно-белом изображении является метод цветового кодирования. Суть метода состоит в том, что в исходном черно-белом изображении различные уровни яркости отображаются различными цветами. Данный метод позволяет выявлять слабоконтрастные области, и таким образом, увеличивает контраст. Данный метод широко применяется в тепловизорах, при регистрации изображений в ИК лучах. Так же метод применяется при обработке рентгенограмм космических снимков. В России с 1985 по 1991 г. выпускалась установка УАР-2 (Установка для Анализа Рентгенограмм-2). Рентгенограммы или негативы (позитивы) размещались на столе с нижней подсветкой, и с помощью видеокамеры изображения обрабатывались специальным блоком обработки и отображались на мониторе. В этом устройстве было реализовано цветовое кодирование.

3.4.3 Метод цифровой трансформации.

Брумберг Евгений Михайлович (ГОИ, Санкт Петербург). в 1939 г. предложил оригинальный метод цветовой трансформации, который позволяет преобразовать трехкомпонентные спектральные изображения с микроскопа в видимое изображение в условных цветах. Суть метода состоит в том, что с помощью специальных светофильтров фотографируется микропрепарат для трех длин волн в ультрафиолетовой части спектра. Затем три полученных негатива проектируются на экран через три светофильтра – красный, зеленый и синий. На экране получается высококонтрастное изображение в псевдоцветах.

72

Глава 4. Наблюдение мельчайших частиц с помощью микроскопа.

Обычно разрешение оптических микроскопов равно 500 нм (увеличение 2200х). Теоретически возможное разрешение оптических микроскопов – 220 нм.

Броуновское движение.

Броуновское движение – это беспорядочное движение микроскопических видимых, взвешенных в жидкости частиц твердого вещества, вызываемое тепловым движением частиц жидкости. Броуновское движение никогда не прекращается. Броуновское движение открыто в 1827 году Броуном, когда он проводил исследование пыльцы растений. Размер частиц, которые совершают броуновское движение – от 0,2 до 5,5 мкм. Интенсивность броуновского движения возрастае с повышением температуры и при уменьшении размеров частиц. Мельчайшие частицы ведут себя как живые.

1676 – Антонии Левенгук – Голландия.

Впервые бактерии увидел в оптический микроскоп и описал в 1676 году голландский натуралист Антони ван Левенгук. Как и всех микроскопических существ, он назвал их «анималькули». Левенгук увидел микроорганизмы в капле воды. Однажды Антони ван Левенгук порезал палец и рассмотрел кровь под микроскопом. В однородной красной жидкости он увидел многочисленные образования розоватого цвета, напоминающие шарики. В центре они были чуть светлее, чем по краям. Левенгук назвал их красными шариками. Впоследствии их стали называть красными кровяными клетками.

Название «бактерии» ввёл в употребление в 1828 году Христиан Эренберг.

В 1850-х годах Луи Пастер положил начало изучению физиологии и метаболизма бактерий, а также открыл их болезнетворные свойства.

Дальнейшее развитие медицинская микробиология получила в трудах Роберта Коха, которым были сформулированы общие принципы определения возбудителя болезни (постулаты Коха). В 1905 году он был удостоен Нобелевской премии за исследования туберкулёза.

73

1900? - Antoine Bechamp - France

Французский биолог Антуан Бишам (Antoine Bechamp) (1816-1908) исследовал мельчайшие частицы в растениях, мельчайшие частицы жизни. Он назвал их “mikrozyma”.

-Antoine Bechamp. The blood and its Third Element. Review Press. 2002. 236 pages.

1902 – Zigmondy – Germany - Ultramicroscope

Ультрамикроскоп (ultramicroscope) - оптический прибор для обнаружения частиц столь малых размеров (до 2 нм), что их нельзя наблюдать в обычные микроскопы. В ультрамикроскоп наблюдаются не сами частицы, а большие по размерам пятна дифракции света на них. Размеры и форму частиц в ультрамикроскоп установить нельзя, однако можно определить их концентрацию. Конструкцию ультрамикроскопа предложили в 1902 г. профессор Геттингенского университета, австрийский химик Р. Зигмонди (Richard Adolph Zsigmondy) (1865-1929) и немецкий физик Зидентопф (Нenry Friedrich Wilhem Siedentopf) (1872-1940). С 1897 по 1907 год Зигмонди работал профессором в Йенском Университете, где вместе с оптиком Зидентопфом разработал ультрамикроскоп для наблюдения за коллоидными растворами. Темнопольный конденсор был разработан Зидентопфом. Кювета, содержащая изучаемое вещество, освещается с помощью косого освещения.

В1913 г. в целях повышения апертуры объектива микроскопа, Зигмонди предложил конструкцию щелевого иммерсионного ультрамикроскопа, в котором осветительный и наблюдательный объективы касались друг друга. При этом наблюдения производились без кюветы, а раствор помещался непосредственно между объективами. Объект освещается через узкую прямоугольную щель, расположенную сбоку. Изображение щели проектируется в зону наблюдения. В окуляр наблюдательного микроскопа видны светящиеся точки (дифракционные пятна) частиц, находящихся в плоскости изображения щели. Выше и ниже освещенной зоны присутствие частиц не обнаруживается.

Вдальнейшем было обнаружено, что наблюдения по методу темного поля можно проводить и с обычным микроскопом, снабженным специальным конденсором (темнопольный метод). Зигмонти предложил классификацию коллоидных частиц по их видимости в ультрамикроскоп и по их взаимодействию со средой.

Рис. 4-1. Схема освещения в щелевом ультрамикроскопе.

74

Метод ультрамикроскопии позволяет обнаружить чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. С помощью иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 2×10-9 м. Однако определить форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода невозможно: их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Т. к. подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются главным образом в коллоидной химии для изучения мелких частиц в растворах. Ультрамикроскоп позволяет считать количество коллоидных частиц и изучать их движение. С помощью ультрамикроскопа можно регистрировать частицы размером от 2 нм.

Проточный ультрамикроскоп.

Конструкцию проточного ультрамикроскопа предложили в 1953 году советские ученые Дерягин Борис Владимирович и Власенко Г.Я.

-Дерягин Б.В. Власенко Г.Я. Проточный ультрамикроскоп ВДК-4 Коллоидный журнал. 1951. №

4. -249 с.

-Дерягин Б.В. Власенко Г.Я. Проточная ультрамикроскопия, «Природа», 1953, №11.

Поток жидкости с частицами направляется по трубке навстречу глазу наблюдателя. Частицы, пересекая зону освещения, регистрируются как яркие вспышки визуально или с помощью фотометрического устройства. Регулируя яркость светового потока подвижным клином фотометрическим, можно выделять для регистрации частицы, размер которых превышает заданный предел. С помощью поточного ультрамикроскопа удаётся определять частичные концентрации золей вплоть до 1010 частиц в 1 см3.

В ЛОМО в 1961 году выпускался поточный ультрамикроскоп ВДК-4, предназначенный для определения концентраций аэрозолей, гидрозолей и других коллоидно-дисперсных систем. Принцип действия данного прибора основан на регистрации числа коротких вспышек, возникающих в момент просасывания аэрозоля через кювету, ярко освещенную светом.

Рис. 4-4. Принципиальные схемы щелевого (а) и поточного (б) ультрамикроскопов: 1-источник света; 2-конденсатор; 3-оптическая щель; 4-осветительный объектив; 5-кювета; 6-наблюдательный микроскоп; 7-фотометрический клин.

76

1920 – США – San Diego - Royal Rife - Универсальный микроскоп Райфа.

Роял Реймонд Райф (Royal Raymond Rife) (1888-1971) был страстно влюблен в бактериологию, микроскопы и электронику.

В1913 году он работал на фирме Zeiss и учился у самого Carl Zeiss. Он занимался разоаботкой новых микроскопов. В 1920 году он уехал в США.

В1917 году начал и в 1922 году закончил создание первой модели микроскопа.

В1929 году создал вторую модель микроскопа (Prismatic Microscope model)

В1933 он усовершенствовал микроскоп и построил третью модель (Universal Microscope) - невероятно сложный Универсальный Микроскоп, который имел почти 6 000 различных частей и был способен к увеличению объектов в 60 000 раз от их истинного размера.

Рис. 4-5. Royal Rife за микроскопом.

Рис. 4-6. Первая модель микроскопа Ральфа – “Virus Microscopes” number 1. 1917 год.

77

Для повышения качества изображения в микроскопе использовалось несколько принципов.

1 – Использование принципа обратимости.

Для повышения разрешающей способности микроскопа Райф использовал принцип обратимости. Из принципа обратимости следует, что если отраженный или преломленный луч посылается в обратном направлении, то он повторит свой начальный путь. В соответствии с этим принципом он выходном окне (в окуляре) использовал такой же оптический объектив, как и в входном окне. Дифракционное изображение светящейся точки представляет собой систему светящихся колец. Если это изображение направить через систему линз эквивалентную исходной, то будет восстановлено изображение светящейся точки. Между входным и выходным объективами помещается оптический блок из призм. Входная и выходная поверхности призмплоские. Промежуточные поверхности призм – вогнутые. Промежуточный блок формирует выходной световой поток с углом расходимости, равном углу расходимости входного пучка. Световой поток, поступающий в выходной объектив все еще содержит дифракционную Катину исходного изображения. Но после прохождения выходного объектива, идентичного входному объективу, дифракционная картина пропадает (компенсируется).

Рис. 4-9. Оптическая схема промежуточного блока микроскопа с однократным набором призм.

Рис. 4-10. Оптическая схема промежуточного блока микроскопа с тройным набором призм.

80