2 курс / Гистология / Малышев_М_Е_Патогенетическое_и_диагностическое_значение_нарушений

61

castra, UK). Перечень изученных субпопуляций мононуклеаров костного мозга представлен в таблице 7.

62

2.3.2. Методы исследования иммунитета и неспецифической резистентности

2.3.2.1. Гематологическое исследование крови

Гематологическое исследование выполняли на автоматическом анализаторе КХ–21 (Sismex). Оно включало в себя общеклиническое исследование крови, с обязательным определением:

1.Количества эритроцитов

2.Количества ретикулоцитов

3.Гемоглобина

4.Гематокрита

5.Среднего объема эритроцитов (MCV)

6.Ширины распределения эритроцитов по объему (RDW)

7.Среднего содержания гемоглобина в эритроците (MCH)

8.Средней концентрации гемоглобина в эритроците (MCHC)

9.Количества лейкоцитов

10.Количества тромбоцитов 11. Относительного и абсолютного числа популяций лейкоцитов крови (лим-

фоцитов, моноцитов, нейтрофильных гранулоцитов)

2.3.2.2. Иммунофенотипирование клеток крови

Иммунофенотипирование фенотипических и активационных маркеров клеток крови с помощью иммуноцитохимического метода (Novocastra, UK).

Для постановки реакции из 4 мл венозной крови выделяли мононуклеары крови на градиенте плотности фиколл-верографина (плотность 1,077) и нейтрофильные гранулоциты (плотность градиента 1,119) [136]. Чистота выделения клеточных популяций составляла 90-97%. Клеточную суспензию дважды отмывали при центрифугировании (1200 об/мин) в 10 мл среды Хенкса без фенолового красного. Исследовали содержание CD3, CD4, CD8, CD11b, CD16, CD18, CD20, CD25, HLA-I, HLA-DR – положительных моно-

нуклеаров и Defensin – положительных нейтрофильных гранулоцитов.

63

Образцы последовательно инкубировали:

-с блокирующей сывороткой;

-с моноклональными антителами (мышиными или кроличьими) определенной специфичности к определенным клеточным антигенам;

-с биотинилированными связывающими антителами к мышиным или кроличьим иммуноглобулинам;

-со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой;

-окраска хромогеном (диаминобензидин)

-докрашивание гематоксилином Карацци.

Для большинства моноклональных антител достаточно 10-минутной инкубации. Для каждой новой серии специфических и связывающих и /или антител с меткой подбиралась оптимальная рабочая концентрация в разведении от 1:10 до 1: 300 в зависимости от качества реагента. Оптимальная концентрация антител - это наименьшая концентрация, при которой позитивные клетки еще имели интенсивное специфическое окрашивание. Эту концентрацию принимали за рабочий титр антител. Использовали максимально возможное разведение, так как это снижало интенсивность неспецифического фонового окрашивания.

При микроскопии идентифицировали окрашенный продукт иммуноферментной реакции (черно-коричневый) при использовании диаминобензидила в качестве хромогена, образующийся в местах связывания выявляемых антигенов. Учет результатов проводили в световом микроскопе при суммарном увеличении х 900 (окуляры 15, объектив 60) или с использованием масляной иммерсии(окуляры 15, объектив 90). Положительно окрашенной считалась клетка, по окружности которой окрашенный продукт реакции занимал не менее трети. Подсчет проводили на 200 клеток, определяли процент положительно окрашенных клеток.

64

2.3.2.3. Исследование содержания иммуноглобулинов

Определение содержания иммуноглобулинов классов A, G, М проводили методом иммуноферментного анализа (ИФА) (Вектор-Бест, Новосибирск).

2.3.2.4. Исследование концентрации цитокинов

Концентрацию цитокинов IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL18, IL1ra, IFNγ, TNFα, GM-CSF, ЕРО в сыворотке крови определяли методом ИФА (Bender Systems, Австрия).

2.3.2.5. Исследование содержания в крови гормонов

Содержание гормонов в сыворотке крови определяли методом ИФА: кортизола, тиреотропного гормона (ТТГ), свободного тироксина (Т4св) (АлкорБио, Санкт-Петербург), пролактина (ХЕМА, Москва).

2.3.2.6. Исследование содержания белка S-100β

Содержание в сыворотке крови белка S-100β исследовали методом ИФА (CanAgS100 EIA, Швеция).

2.3.2.7. Исследование оксидантной и антиоксидантной активности

клеток крови и костного мозга

Исследовали хемилюминесценцию как цельной крови, так и популяций мононуклеаров (эмиссия света определяется преимущественно моноцитами крови, но не лимфоцитами) и полиморфноядерных лейкоцитов крови [9]. Клеточные популяции выделяли на двойном градиенте плотности фиколлверографина (1,077 и 1,119). Полученные клетки крови трижды отмывали в 10 мл среды Хенкса без фенолового красного. Измеряли люминолопосредованное (раствор люминола 1*10-4М) спонтанное и индуцированное суспензией зимозана (0,2 % раствор в ФСБ, рН 7,4) свечение клеток крови в течение часа с интервалом 10 мин при 37° С на люминометре 1251, BIO-ORBIT (Финляндия). Индуцирование хемилюминесценции осуществляли, добавляя в инкубационную среду 0,2% раствор зимозана, опсонизированного комплементом. Измерение и учет результатов производили в автоматическом режиме (персональный компьютер, программа «PHAGOCYTOSIS»). Уровень ХЛ оценивали по

65

сумме показателей в течение 60 мин и величине пика ХЛ (в мВ). Спонтанная ХЛ (СХЛ) отражает уровень продукции супероксидов и бактерицидность активированных лейкоцитов крови, а величина индуцированной ХЛ (ИХЛ) – резерв клеточного метаболизма и бактерицидности.

Для оценки общей антиоксидантной активности (АОА) использовали реакцию рибофлавина с перекисью водорода в присутствии ионов двухвалентного железа. Реакционная смесь содержит 610 мкл 75 мМ фосфатного буфера (рН 9,0), 40 мкл 10 мМ раствора рибофлавина, 50 мкл 25 мМ раствора FeSO4, 200 мкл 20 мМ раствора Н2О2 и 100 мкл бидистиллированной воды. В опытную пробу вместо бидистиллированной воды вносят 100 мкл сыворотки или плазмы крови. Измерение хемилюминесценции осуществляли в течение 2 мин. при температуре 37о С. ОАА выражали в условных единицах на 1 мг белка, рассчитывая её по формуле:

АОА = (1 – ССоп./ССк.) / А Где: ССоп. – величина суммы показателей ХЛ опытного образца; ССк. –

величина суммы показателей ХЛ контрольной пробы; А – содержание белка в реакционной смеси.

2.3.3. Методы оценки активности воспалительного процесса у больных с

сочетанной травмой

Определение в крови концентрации С-реактивного белка (СРБ) проводили полуколичественным методом латексной агглютинации (Human, Германия).

Измерение концентрации в крови прокальцитонина (ПКТ) проводили количественным иммунолюминометрическим методом (БРАМС АГ, Германия) на приборе «Lumat LB 9507»(Германия).

2.3.4. Исследование парциального напряжения О2 и СО2 в артериальной

крови у больных с сочетанной травмой

Определяли парциальное напряжение О2 и СО2 в артериальной и смешанной венозной крови, pH артериальной и смешанной венозной крови. Оп-

66

ределение парциального напряжения газов крови, pH крови производилось на газоанализаторе Stat Profile Ultra (Nova biomedical, США). Расчетные па-

раметры газообмена получали, используя формулы, приведенные в стандартах NCCLS, монографиях Г.А. Рябова [86]. Исследования выполнены в кли- нико-диагностической лаборатории ГБУ СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе, зав. лаб. к.м.н. Ковальчук Ю.П..

2.3.5. Микробиологическая диагностика гнойных осложнений

Чувствительность микрофлоры к антибактериальным препаратам определяли методом диффузии в агар с использованием стандартных дисков в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Количественное изучение содержания микробов в 1 грамме ткани проводили по классической методике, предложенной Teplitz C. et al. (1964). При количественной оценке диагностически значимыми считали титры микробных тел ≥ 105 КОЕ/мл. Бактериологическое исследование крови осуществляли в бактериологической лаборатории СПб НИИ СП им. И.И. Джанелидзе, зав.лаб. Попенко Л.Н..

2.4. Методы статистического анализа

Обработку полученных данных проводили с помощью прикладных программ Excel, SPSS 17.0 и Statistica for Windows 6.0. Все данные представ-

лены в виде средних M±m или медианы с 25% и 75% квартилями, нормальность распределения выборки оценивали при помощи критерия ШапироУилка, в рамках корреляционной связи вычисляли коэффициент Пирсона и Спирмена (r), различие признаков поводили при помощи U-критерия МаннаУитни. Для определения пороговых значений предполагаемых лабораторных предикторов развития сепсиса и тяжелого сепсиса применяли построение ROC-кривой и ее анализ [127]. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину Р< 0,05.

67

Глава 3. Влияние этиологических и патогенетических факторов

сочетанной травмы на развитие воспаления у пострадавших

(результаты собственных исследований)

3.1. Влияние факторов патогенеза сочетанной травмы –

кровопотери, гипоксии, оксидантного стресса на течение и

исход травматической болезни

В зависимости от тяжести травматического шока пострадавшие были разделены на 2 группы: 1) с шоком II степени (n=46) и 2) с шоком III степени (n=42), которые в последствии, в зависимости от исхода заболевания, были разделены на подгруппы выживших и умерших пациентов (таблица 8).

Таблица 8 Общая характеристика групп пострадавших с сочетанной травмой

Первую группу составили 46 пострадавших с сочетанной травмой, сопровождавшейся шоком II степени. В этой группе средний балл шокогенности травмы (БШТ) по шкале Ю.Н.Цибина c cоавт. (1976) составил 17,0. Количество койко-дней составило от 13 до 37 суток. Все пострадавшие этой

68

группы получили лечение в отделении реанимации и интенсивной терапии в течение 1-5 суток. Оперативная активность составила 100%: каждому пострадавшему выполнено от 2 до 4 операций. У 14 пострадавших (30,4%) течение травматической болезни было благоприятным и не было обнаружено развития гнойных осложнений (пациенты с ССВО). У 32 пострадавших 1 группы гнойные осложнения (сепсис и тяжелый сепсис) развились на 4-6 сутки после травмы. В качестве критериев для постановки диагноза «сепсис» и «тяжелый сепсис» мы использовали рекомендации Калужской согласительной конференции, 2004 г. При анализе материалов историй болезни у 32 пациентов были выявлены очаги гнойной инфекции: пневмония и гнойный трахеобронхит - у 28 пострадавших, нагноение ран – у 9, острый геморрагический цистит – у 2, инфицированные пролежни – у 3, гнойный пиелонефрит

– у 2, абсцесс брюшной полости – у 2. Тяжелый сепсис выявлен у 12 пациентов (26,1%) этой группы, 6 из которых умерли в посттравматическом периоде на 7-14 сутки. Каждому пострадавшему этой группы выполнено от 2 до 6 операций.

Во вторую группу вошли 42 пострадавших с сочетанной травмой, сопровождавшейся шоком III степени. Каждому пациенту этой группы выполнено от 3 до 7 оперативных вмешательств. У всех пострадавших к 4-6 суткам были диагностированы гнойные осложнения, у 52% наблюдали развитие полиорганной недостаточности и тяжелого сепсиса. 19 человек умерли в промежутке от 5 до 24 суток после поступления. Летальность, таким образом, составила 45%. Продолжительность лечения выживших пациентов составила

всреднем 45 суток.

Увсех пострадавших с сочетанной травмой в отделении противошоковой терапии констатировали тяжелую степень кровопотери, объем которой составлял от 1600 до 3500 мл, в среднем 2325 мл. Однако достоверных различий по объёму кровопотери между группами не выявлено (таблица 9).

69

Таблица 9 Кровопотеря и объем гемотрансфузий (мл) у пострадавших с сочетан-

ной травмой

Все пострадавшие получили инфузии эритроцитарной массы (от 199 до 849 мл) и свежезамороженной плазмы (от 500 до 1250 мл). При этом мы не наблюдали достоверного отличия по уровню объема перелитой эритроцитарной массы и плазмы между больными обеих групп.

Прямым следствием массивной кровопотери является развитие гипоксии смешанного типа, обусловленной гипоксической гипоксией вследствие нарушения внешнего дыхания, циркуляторной гипоксией в результате расстройств общего и регионарного кровообращения и микроциркуляции, гемической и тканевой гипоксией, связанной с кровопотерей и нарушениями ки- слотно-основного состояния [58]. Гипоксия, развивающаяся при тяжелой механической травме, сопровождается отчетливым угнетением гуморального иммунного ответа, и наравне с болевой афферентацией и кровопотерей, превышающей 20% объема циркулирующей крови, выступает в качестве патогенетического иммуносупрессивного фактора травматической болезни [5].

Через 24 часа после поступления в противошоковое отделение у пострадавших всех групп наблюдалось уменьшение РаО2 в артериальной крови, но

70

у пациентов с шоком III степени тяжести снижение сохранялось до 5 суток наблюдения (таблица 10).

Таблица 10 Уровень РаО2 (мм рт.ст.) в артериальной крови у пациентов с СМТ

Таким образом, через 24 часа после травмы тяжелая гипоксия развивалась у пострадавших всех групп, однако сохранялась только у больных с наиболее тяжелой травмой вплоть до 5 суток после инцидента.

Одним из критериев синдрома системного воспалительного ответа при критических состояниях считается развитие метаболического дистресссиндрома, в частности, оксидантного стресса, который проявляется усилением продукции активных форм кислорода (АФК) клетками крови, перекисного окисления липидов (ПОЛ) при одновременно недостаточном антиоксидантном потенциале крови [32, 363]. При этом усиление продукции АФК являет-