2 курс / Биохимия / Обмен белков и ферменты

бензольное кольцо) радикалов аминокислот и образование нитропроизводных, окрашенных в желтый цвет. При подщелачивании окраска усиливается.

Проведение реакции: к 4–5 каплям раствора белка добавляют 2– 3 капли концентрированной азотной кислоты. Образуется осадок белка, который при осторожном нагревании на водяной бане окрашивается в желтый цвет. К охлажденной (!) пробе добавляют избыток аммиака – появляется оранжевое окрашивание. Аналогичным образом проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: реакцию дают соединения, имеющие бензольные кольца в молекуле.

Реакция Сакагучи. Реакция на аргинин обусловлена образованием в щелочной среде ярко-красного продукта конденсации гуанидиновой группировки с α-нафтолом.

+

(CH2)3

CH-NH2

COOH

11

Выделяющийcя при реакции аммиак разлагается гипобромитом:

2NH3 + 3NaBrO → N2 + 3H2O + 3NaBr.

Проведение реакции: к 4–5 каплям раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора NaOH и 3 капли спиртового раствора α- нафтола. После перемешивания добавляют 2–3 капли 2 % раствора NaBrO. Появляется малиново-красное окрашивание. Так же проводят реакцию с желатиной.

Специфичность: реакция характерна для соединений, содержащих гуанидиновую группировку.

Реакция Фоля (реакция на слабосвязанную серу). При наличии в молекуле белка или пептида сульфгидрильных (тиоловых) групп SH щелочной гидролиз приводит к отщеплению серы в виде сульфида и при добавлении ионов Pb+2 к образованию черного осадка PbS.

+Na2S + H2O

2.(CH3COO)2Pb + 4NaOH → Na2PbO2 + 2CH3COONa + 2H2O

3.Na2S + Na2PbO2 + CH3СOOH PbS + CH3COONa

сульфид свинца черного цвета

12

Если в реакцию включаются дисульфидные группы остатков цистеина, то они должны вначале подвергнуться восстановительному расщеплению.

Проведение реакции: при добавлении к нескольким каплям раствора ацетата свинца избытка 10 % раствора гидроксида натрия образуется щелочной раствор плюмбита натрия. К нему приливают несколько капель раствора белка. Смесь нагревают на кипящей водяной бане. Раствор окрашивается в темно-бурый цвет. Так же проводят реакцию с желатиной.

Специфичность реакции: реакция характерна для соединений, содержащих тиоловые группы. Результаты работы представлены в табл. 1.

Вывод: _________________________________________.

Клинико-диагностическое значение цветных реакций

1.Цветные реакции используют для диагностики заболеваний, при которых происходит:

– наследственное нарушение метаболизма отдельных аминокислот (фенилкетонурия, гомоцистинурия – методы смотри ниже);

– усиленный распад тканевых белков (злокачественные новообразования, гипертиреоз, ожоги);

– нарушение реабсорбции аминокислот в почках.

2.С помощью цветных реакций можно оценить качественный и количественный состав белков и пептидов в биологических жидкостях, а также полноценность белков в пищевых продуктах.

13

3. В санитарно-гигиенической практике цветные реакции используют для количественного и качественного определения белковых веществ (загрязнений) во внешней среде (атмосферном воздухе, сточных водах и др.).

Скрининг-тесты для выявления наследственных и приобретенных нарушений белкового обмена

Обнаружение цистина и гомоцистеина

Ход исследования. Каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу и после высушивания добавляют одну каплю азида натрия. В течение 5 мин наблюдают за исчезновением бурой окраски. Исчезновение бурой окраски через 2–3 мин после добавления азида натрия указывает на нормальные величины.

Клинические значения: тест положителен при наследственной гомоцистинурии (дефицит синтеза фермента цистатионинсинтетаза) или приобретенной (дефицит витаминов В6, В12, фолиевой кислоты), в этом случае окраска остается более 5 мин.

Для диагностики заболеваний белкового обмена также используют скрининг-тесты на обнаружение кетокислот, так как нарушения обмена аминокислот сопровождаются образованием и накоплением соответствующих кетокислот и экскрецией их с мочой в большом количестве.

Обнаружение кетокислот (проба с треххлористым железом). К 0,5 мл мочи добавляют 0,25 мл раствора треххлористого железа. О наличии кетокислот судят по характеру окраски (проба положительна); сине-зеленое окрашивание указывает на наличие фенилпировиноградной кислоты, а желтое – на избыток пирувата в моче.

Обнаружение кетокислот по реакции с 2,4-динитрофенилгидра- зином. Смешивают 1 мл раствора 2,4-ДНФГ и 0,25 мл мочи. При положительной пробе развивается окраска от желтой до оранжево-корич- невой. В норме проба отрицательная, окраска не развивается.

Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге

Хроматография – это метод разделения компонентов смеси между двумя несмешивающимися фазами. Одной из них является неподвижная фаза, которая бывает твердой, жидкой или представляет собой смесь

14

твердой и жидкой фаз. Вторая, подвижная, фаза может быть жидкой или газообразной; она обычно течет по неподвижной фазе или пропускается через нее. Поэтому в зависимости от агрегатного состояния фаз хроматографию разделяют на жидкостную, газовую и газожидкостную.

В зависимости от природы адсорбента и механизма разделения веществ хроматография бывает нескольких видов:

–адсорбционная – основана на различной способности отдельных компонентов смеси адсорбироваться на поверхности твердой фазы сорбента; этот метод предложен М.С. Цветом в 1903 г.;

–распределительная – основана на различной растворимости разделяемых веществ в двух малосмешивающихся жидкостях;

–ионообменная – основана на различной способности разделяемых веществ к обмену их ионов на ионы неподвижной фазы;

–осадочная – основана на образовании труднорастворимых осадков

вопределенной последовательности;

–диффузионная – основана на разделении веществ по скорости диффузии внутрь сорбента в зависимости от размера молекул неподвижной фазы (к данному типу относится гель-фильтрация);

–аффинная – основана на сродстве компонентов смеси к лигандам неподвижной фазы.

Хроматографические методы анализа различают и по технике выполнения: колоночная (используется для разделения высокомолекулярных соединений), капиллярная, плоскостная (на бумаге или в тонком слое силикагеля). По направлению движения растворителя (подвижной фазы) различают восходящую, нисходящую, двухмерную и радиальную. В настоящее время наибольшее распространение получила высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ или НРLC (high performance liquid chromatography).

Для разделения аминокислот используют бумажную, нисходящую, распределительную хроматографию.

Принцип метода: отдельные аминокислоты обладают различной растворимостью в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель. Более гидрофобная аминокислота, лучше растворяющаяся в неполярном растворителе, движется с большей скоростью от линии старта, чем гидрофильная аминокислота. В результате этого смесь аминокислот по окончании хроматографического разделения оказывается на разном расстоянии от линии старта.

15

Хроматограмму окрашивают 0,2 % раствором нингидрина и высушивают при температуре 90–100° С в течение 5 мин. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения Rf по формуле.

Сравнивают коэффициенты распределения «свидетелей» – известных аминокислот и аминокислот исследуемой смеси для качественного анализа исследуемой жидкости.

Хроматографические методы, например газовая хроматография, используются во многих областях медицины: в гигиене и экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах; в токсикологии и судебной медицине для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры; в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, для анализа компонентов растительного сырья, исследования метаболизма лекарственных препаратов.

16

Тема 2. ПРОТЕОМИКА. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА

Место проведения: кафедра биохимии. Продолжительность занятия – 180 мин.

Цель занятия: систематизировать знания о строении белковых молекул. Освоить метод количественного определения белка в сыворотке крови и изучить возможность его использования для диагностики патологических состояний.

Конкретные задачи.

Студент должен знать:

–структурные уровни организации белковых молекул;

–устройство фотоэлектроколориметра, правила работы с ним и возможности использования фотоколориметрического метода в клини- ко-биологических исследованиях;

–количественные методы определения белков в биологических жидкостях.

Студент должен уметь:

–работать с калиброванными пипетками, бюретками и микробюретками;

–пользоваться фотоэлектроколориметром;

–обрабатывать и графически отображать полученные результаты. Студент должен владеть алгоритмом работы на фотоколори-

метре.

Мотивация. Определение концентрации белка в сыворотке крови представляет для врача практический интерес с точки зрения лабораторной диагностики патологических состояний, оценки эффективности лечебных мер, анализа пищевой ценности продуктов.

Изучение темы должно способствовать формированию общекультурных (ОК-5) и профессиональных (ПК-9, ПК-15) компетенций.

Задание для самоподготовки: изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

Рекомендуемая литература

Основная

Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :

Медицина, 1998. – С. 49–77, 568–569, 572–573, 661–665.

17

Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :

ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 14–28, 19–45, 32–38, 55–67; То же. – 2011. – С. 14–28, 30–38.

Белки и ферменты : учебно-методическое пособие к практическим заняти-

ям по биологической химии / под ред. проф. В.А. Дадали, доц. Р.Н. Павловой. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013.

Вопросы для самоподготовки

1.Что такое белки? Какие функции они выполняют в организме человека?

2.Какие аминокислоты входят в состав белков? Приведите их классификацию.

3.Первичная структура белковой молекулы. Какие связи стабилизируют первичную структуру?

4.Вторичная структура белка – модель Полинга–Кори. Виды вторичной структуры и связи, ее стабилизирующие.

5.Третичная структура белка. Основные виды третичной структуры

исвязи, ее стабилизирующие.

6.Характеристика четвертичной структуры белка.

7.Биологическая роль первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур белка.

8.Характеристика методов количественного определения белка в растворах.

9.Какой физический закон лежит в основе количественных спектрофотометрических методов исследования?

11.Какова норма содержания белка в сыворотке крови человека?

12.Что такое гипо- и гиперпротеинемия? Причины этих состояний.

Пример входного контроля

1.Напишите формулу трипептида: Тир–Ала–Лиз.

2.Можно ли назвать вещество белком, если ксантопротеиновая реакция (+), а нингидриновая (–)?

3.Какие связи стабилизируют третичную структуру белка?

18

Методы количественного определения белков

1.Азотометрический метод Кьельдаля основан на определении со-

держащегося в белке азота. Белок минерализуют. Углерод при этом окисляется до СО2, водород образует воду, а азот выделяется в виде NH3. Аммиак связывается серной кислотой и превращается в сернокислый аммоний. В специальном приборе сернокислый аммоний разлагается концентрированной щелочью с образованием аммиака. Аммиак перегоняется и улавливается титрованным раствором серной кислоты. Избыток кислоты, не вступивший в реакцию с аммиаком, оттитровывают раствором щелочи. Для определения наличия аммиака в воздухе ставят контрольную пробу, в которой вместо анализируемой жидкости берут дистиллированную воду. Полученные данные вычитают из данных опыта. Результаты определения концентрации азота умножают на 6,25, так как концентрация азота в разных белках составляет примерно

16 %.

2.Весовые (гравиметрические) методы основаны на высушивании белковых растворов до постоянной массы и определении веса белков на аналитических весах.

3.Рефрактометрические методы основаны на определении с по-

мощью рефрактометра коэффициента преломления света (n20D ) белкового раствора при 20° С.

Степень рефракции раствора обусловлена количеством, размерами, физическим состоянием растворенных в нем частиц, а также температурой окружающей среды. В сыворотке крови величина рефракции зависит в первую очередь от количества и качества белков. Определив значение показателя преломления, по таблице перевода показателей рефрактометра в единицы концентрации находят величину концентрации белка.

4. Спектрофотометрические методы основаны на определении поглощения белковых растворов при 280 нм.

Из аминокислот, входящих в состав белков, лишь триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин обладают заметным поглощением в ультрафиолетовой области спектра. Оптическая плотность растворов белков, содержащих эти аминокислоты, при 280 нм прямо пропорциональна концентрации белка в растворе. Поскольку большинство белков содержит остатки тирозина, измерение поглощения при 280 нм с помощью спектрофотометра представляет собой быстрый и удобный способ определения содержания белков в растворе. Этот метод дает

19

хорошие результаты с гетерогенной смесью белков, а также с препаратами индивидуальных белков, молярный коэффициент экстинкции которых может быть измерен или вычислен, исходя из аминокислотного состава. Концентрацию белка рассчитывают, исходя из известного коэффициента экстинкции (D = ∙C ∙ l, C = D/ ∙ l) или определяют с помощью предварительно построенной калибровочной кривой. Если коэффициент неизвестен, можно воспользоваться номограммой Адамса. На номограмме на шкалах 2 и 3 отложены значения оптической плотности растворов белка соответственно при 280 и 260 нм, на шкале 1 – концентрация белка в мг/мл. Определяют оптическую плотность исследуемого раствора белка при 280 и 260 нм. Через соответствующие точки на шкалах 2 и 3 проводят воображаемую прямую, точка ее пересечения со шкалой 1 дает концентрацию белка в растворе. Использование номограммы Адамса удобно еще и потому, что при этом учитывается загрязнение раствора белка нуклеиновыми кислотами, которые имеют максимум поглощения при 260 нм.

5. Фотоколориметрические методы основаны на измерении по-

глощения окрашенных продуктов реакции в видимой области спектра. В клинической и санитарно-гигиенической практике наиболее распространены спектрофотометрические и фотоколориметрические мето-

ды количественного определения белка.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Биуретовый (унифицированный) метод

Принцип метода: белок реагирует в щелочной среде с сульфатом меди, при этом образуются соединения, окрашенные в фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Оптическая плотность окрашенного раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется колориметрически.

Материал для исследования: сыворотка крови. Расчет ведут по калибровочному графику или методом сравнения с эталонным (стандартным, калибровочным) раствором белка с известной концентрацией. Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. На правильность метода влияет качество калибровочного материала. Некоторые вещества оказывают интерферирующее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкм/л, триглицериды – больше

11,4 ммоль/л.

20