210 |
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков |
ние ангидрида протекает даже при соотношении ДЦК и карбоксильной груп пы iV-защищенной аминокислоты 1:1, поскольку карбоксильная группа реа гирует с О-ацилизомочевиной быстрее, чем с ДЦК.
Кроме того, происходят побочные реакции, приводящие к нереакционно способным побочным продуктам.
|
|
f , |
|
|
О |
V |
R i-C H — С, |
NH |
|
Ri—СН— С |
NH |
||
I |
|
/ |
\ |
|||
I |
О |
-с |
- |
+ 0=С |
||
|
||||||
Hr N ^ |
|
II -у |
|
N^ . |
/ ° |
NH |
|
|
N V |
|
|||
ЧС=Ю |
|
|
|
СН |
||
|
|
|
|
|
|
Р |
J |
|
9 |
* |
R -I-C H -C . / " ^ N H |
R-j—СН-С—N |
|||
1 . 4 ^ |
, |
|
|
|
|
|
h h !i |
0=6 |
|
|
|
С=0 |
NH |
|
|
|
> |
|
^2 |
Вприсутствии других нуклеофилов протекающие с ними реакции О- ацилизомочевины уменьшают уровень приведенных выше побочных пре вращений. Условия, в которых предпочтительно протекает межмолекулярная нуклеофильная атака О-ацилизомочевины, способствуют уменьшению числа побочных реакций и, следовательно, приводят к получению более чистого конечного продукта, содержащего значительно меньшие количества 5(4Н)- оксазолона или TV-ацилмочевины.
Врастворителях с низкими значениями диэлектрической проницаемости (СС14, СН2С12, С6Н6) образуется значительно меньшее количество N- ацилмочевины, чем в полярных средах (Л/^-диметилформамид (ДМФА), ацетонитрил, диметилсульфоксид (ДМСО), Н20). Это объясняется тем, что
внеполярных растворителях карбоновые кислоты находятся преимущест венно в виде димеров. Например, константа ассоциации уксусной кислоты
вСС14 имеет порядок 2000, тогда как в ацетонитриле - только 0,5. Димеры реагируют с ДЦК в 30 раз быстрее, чем мономеры, образуя с высоким выхо дом ангидриды и почти не давая А^-ацилмочевину.
О-ацилизомочевина, образованная аспарагином, может подвергаться внутримолекулярной циклизации по реакции
|
§10.4. Метод активированных сложных эфиров |
211 |
|
0 |
|
Z -N h |
Z -N H -C H — С |
|
+ о=с
NH
II
NH
§10.4. Метод активированных сложных эфиров
Вначале 1950-х годов для активации карбоксильной группы в пептидном синтезе был предложен новый способ, основанный на использовании слож ных эфиров с хорошей уходящей группой, т. е. активированных эфиров (ме тод активированных эфиров). Впервые этот метод был осуществлен на при
мере я-нитротиофениловых эфиров аминокислот. В дальнейшем в связи с неприятным запахом «-нитротиофенола, выделяющегося в результате реак ции аминолиза, стали использоваться другие нитрофениловые эфиры.
N02
no2 no2
Наибольшее распространение при синтезе пептидов получили «-нитро фениловые эфиры. Особых различий в скоростях ацилирования производны ми мононитрозамещенных фенолов не наблюдается, однако при их получе нии «-нитрофениловые эфиры защищенных аминокислот кристаллизуются лучше других. Высокая стабильность при хранении позволила выпускать коммерчески доступные «-нитрофениловые эфиры защищенных аминокис лот. 2,4-Динитрофениловые эфиры оказались чрезвычайно активными и вследствие этого весьма чувствительными к гидролизу.
Широкое распространение в пептидном синтезе получили и другие ари ловые эфиры. Структурные формулы арильного остатка и реакционная спо собность сложных эфиров (константа скорости ацилирования ко) представле ны в табл.15.
212 |
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков |
Таблица 15 Сравнение реакционной способности активированных эфиров (23 ± 1 °С)
ROH*
ноч0
Н О ^ ) - no2
o2n
О
НО—N
V
О
X |
V |
о |
о |
|
CI |
ноЛ ^С|
CI
Н О -{ } -N Q 2
Название |
А0х102, |
Время аци |
M'V1 |
лирования |
|
|
|
на 90 %, |
|
|
мин |
пентафторфенол |
40 ±9 |
2,9 |
2,4-динитрофенол |
18,4 ±3 |
6,3 |
N-гидроксисукцинимид |
5,4 ± 0,7 |
2 1 |
пентахлорфенол |
1,72 ±0,03 |
62 |
2,4,5-трихлорфенол |
0,3 ± 0,03 |
385 |
«-нитрофенол |
0 , 1 ± 0 , 0 1 |
1088 |
* ROH - спиртовый компонент эфира.
Реакционная способность замещенных ариловых эфиров определяется двумя факторами: 1) константой диссоциации фенольного гидроксила и 2) доступностью реакционного центра атома углерода карбонильной груп пы для нуклеофильного агента. Последнее зависит от степени пространст венного экранирования электрофильного центра за счет введения заместите ля в орто-положение к эфирной связи. Так, сложные эфиры на основе 2,4,5-трихлорфенола (р/£а 9,45) по способности к аминолизу примерно анало гичны и-нитрофениловым эфирам аминокислот (р/Са 9,27). В то же время, хо тя пентахлорфенол (р/Са 5,65) и пентафторфенол (рКг 5,32) имеют близкие величины констант диссоциации ОН-групп, скорость ацилирования пентахлорфениловыми эфирами в результате указанного экранирования в 20 раз ниже, чем соответствующими пентафторфениловыми эфирами. В отличие от атомов хлора, атом F в орто-положении не вызывает пространственного эк
§10.4. Метод активированных сложных эфиров |
213 |
ранирования атома углерода карбонильной группы, так как ван-дер-ваальсов радиус атома фтора значительно меньше, чем у хлора, и ненамного больше, чем у водорода. В связи с этим лучшими в серии сложных эфиров на основе галогензамещенных фенолов можно считать пентафторфениловые эфиры.
Поскольку атомы фтора проявляют сильный электроноакцепторный эф фект и в то же время не создают стерических препятствий, пентафторфени ловые эфиры можно применять для проведения реакции в пространственно затрудненных условиях, например, при твердофазном синтезе. В настоящее время пентафторфениловые и N-гидроксисукцинимидные эфиры являются наиболее широко используемыми вариантами активации карбоксильной группы в аминокислотах при проведении синтеза на полимерных носителях.
Галогензамещенные фениловые эфиры, в отличие от нитропроизводных, предпочтительно использовать, если в ходе синтеза удаление таких защит ных групп, как бензилоксикарбонильные, проводится путем гидрогенолиза, поскольку в противном случае из остаточных количеств «-нитрофенола по лучается высокореакционноспособный «-аминофенол.
Активированные эфиры - очень удобные реагенты для синтеза пептидов. Основным их достоинством является то, что, в отличие от смешанных ангид ридов, они выдерживают длительное хранение и могут быть приготовлены заранее и поэтому выпускаются как коммерческие продукты. Применяя из быток активированного эфира (30-50 %), можно достичь практически коли чественного выхода желаемого продукта на каждой стадии процесса. Избы ток активированных эфиров можно удалять после окончания реакции добав лением А^А^-диметилэтилендиамина. При ацилировании этого амина непро реагировавшим эфиром образуется соединение, способное легко растворять ся в кислотах и поэтому без труда удаляемое при промывках растворами кислот.
Для получения ариловых эфиров защищенных аминокислот используют ДЦК. Реакция между защищенной аминокислотой, ДЦК и нуклеофилом, на пример, «-нитрофенолом, может протекать по двум различным механизмам: 1) через взаимодействие «-нитрофенола с О-ацилизомочевиной и 2) через взаимодействие «-нитрофенола с симметричным ангидридом, образующимся в качестве промежуточного продукта. Если реализуется второй механизм, то аминокислота, освобождающаяся при его реакции с «-нитрофенолом, вновь реагирует с ДЦК, образуя в итоге активированный эфир аминокислоты и Л^ТУ’-дициклогексилмочевину (ДЦГМ). Эти же продукты образуются и при альтернативном механизме.
214 |
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков |
+ R-COOH |
\ |
|
>- О Н 0 К n o 2 |
< 3 - n= c- nh- Q |
|
|
О ~ н о 2 |
|
R—С |
|
|
\О |
+ ДЦГМ |
- о - О - |
R—С/ |
|
|
|
+ ДЦГМ |
|
|
|
§ 10.5. Защитные группы в пептидном синтезе. Блокирование ог-аминогрунп
При проведении ступенчатого синтеза пептидов по а-аминогруппам ис ходных или активированных по карбоксильным группам аминокислот долж ны вводиться временные защиты. За период становления и развития работ по пептидному синтезу было разработано и применено большое число различ ных временных защит. Наиболее широкое применение нашли защитные группы уретанового типа. Подобные группы в кислой среде легко гидроли зуются с последующим самопроизвольным декарбоксилированием образо вавшегося на N-конце остатка карбаминовой кислоты по схеме
О |
о |
0 ^ |
|
0 |
F ^ O -C - N H - C H 'C f |
+ Н+ ------► H 0 - C - N H - C H - C f + R? |
|||
' |
'ОН |
/ |
I |
ОН |
ГЧ2 |
|
/ |
г\2 |
|
со
Первой нашедшей широкое применение временной защитной группой этого типа была бензшоксикарбонтьная группа (Cbz или Z). Она вводится обработкой аминокислоты карбобенилоксихлоридом. Последний может быть получен путем насыщения бензилового спирта фосгеном.
§ 10.5. Защитные группы в пептидном синтезе. Блокирование а-аминогрупп |
215 |
||
С У с н 2он +С0С12— 0 |
|
01 |
|
_ с н 2 °" сС + сГ+ н+ |
|
||
v==/ |
j |
о |
|
О |
V, |
о |
|
H zN -C H 'C -N H 'A / |
-------< ^ > - C H 20 -C -N H -C H -C -N H 'A / |
||
R |
|
O R |
|
В настоящее время этот тип защиты по а-аминогруппам практически не используется, поскольку более удобным оказалось применение третбутипоксикарбонилъной (Вое) группы, которая вводится обработкой амино кислоты отре/я-бутилпирокарбонатом (ВосгО). Поскольку реакция проходит только с депротонированной аминогруппой, ее проводят в присутствии силь ного основания.
о о с — СН—NH2 |
|
О |
СН3 |
||
Н3С—С-О—С-г-О- J—ОС-ОV/—СV/—СНЧ-мiQ3 |
|||||
|
I |
|
|
W |
I |
|
|
СНз |
|
||
|
R |
|
|
СН3 |
|
|
основание |
ди-трет-бути лпирокарбонат |
|||
|
|
|
|
||
СН3 |
О |
|
О |
СН3 |
|
|
/ |
|
II |
I |
|
H3C - C - O - C - N H - C H |
|
-о -с -о —С-СН3 |
н+ |
||
I |
V |
СОО |
|
I |
|
СН3 |
|
|
СН3 |
СН3 |
|
Бос-аминокислота |
|
|
со21 + НО-С-СНз |
||
|
|
|
|
|
СН, |
Эта защита удаляется при более мягких условиях, чем Cbz-группа. Второй широко используемой защитной группой является 9-флуоренш-
метшоксикарбонтъная (Fmoc). Она вводится с помощью 9-флуоренил- метилазидоформиата.
Fmoc-группа стабильна в кислой среде, но отщепляется основаниями: пи перидином, морфолином и др. В результате сильного электроноакцепторного эффекта бензольных колец атом водорода, находящийся в девятом положе нии, приобретает кислый характер и легко отрывается основаниями. Это ве дет к возникновению карбаниона. Легкость деблокирования определяется в данном случае стабильностью карбаниона, который образуется путем Р-элиминирования. Стабильность карбаниона обусловлена делокализацией
216 |
Глава 10. Химический синтез пептидов и белков |
I
R
9-флуоренилметилазидоформиат
отрицательного заряда по всей ароматической дибензоциклопентадиенильной системе. Карбанион быстро распадается, образуя свободный аминокомпонент и дибензофульвен, который дает аддукт с основаниями.
фульвен-пиперидиновый аддукт
В 1970 году для защиты N-конца растущего пептида в практику пептид ного синтеза была введена защитная группа, удаляемая фотохимически -
§ 10.5. Защитные группы в пептидном синтезе. Блокирование а-аминогрупп |
217 |
6-нитровератрилоксикарбонильная защита (NVOC). NFOC-аминокислоты синтезируют путем взаимодействия 6-нитровератрилоксикарбонил-хлорида со свободной Л^-аминогруппой аминокислоты:
|
О |
+ |
11 |
H,N—С Н -С —ОН _____ _ |
|
н . с < А ^ ° ' см' С1 |
2 I |
R |
|
О |
|
NVOC-защитная группа удаляется при облучении соответствующего пеп тида светом с длиной волны 350 нм с выделением С02 и образованием про изводного о-нитробензальдегида. Последнее при дальнейшем облучении мо жет димеризоваться в азосоединение:
+ С О Л* |
+ H ,N - C H - C11- N H “ ^V |
2 |
2 ! |
|
R |
СООН ОСН 3
Эта защитная группа может быть использована для получения чипов, со держащих набор пептидов, методом фотолитографии, подобно получению олигонуклеотидных чипов, описанному в разд. 5.4.2.
218Глава 10. Химический синтез пептидов и белков
§10.6. Блокирование а-карбоксильных групп
Блокирование С-концевых карбоксильных групп в современных методах пептидного синтеза имеет существенно меньшее значение, чем блокирование а-аминогрупп, и необходимо лишь при гомогенном синтезе коротких пепти дов. Образование новых пептидных связей проводится путем реакции акти вированной карбоксильной группы С-компонента с незащищенной амино группой N-компонента, и, естественно, активируемая карбоксильная группа защите не подлежит. При твердофазном пептидном синтезе (§ 10.9) С-конце- вая карбоксильная группа синтезируемого пептида используется для связы вания его с полимерным носителем, т. е. защищена самим носителем. Только при получении коротких пептидов, в том числе для их последующего ис пользования в блочном синтезе, С-концевая СООН-группа должна быть снабжена какой-либо временной защитой.
Для защиты С-концевого карбоксила широко используется его этерификация. Это достигается пропусканием безводного хлористого водорода через раствор аминокислоты в абсолютном метаноле или этаноле. Согласно обще принятому механизму реакции на первой стадии карбоксильная группа протонируется. Это повышает чувствительность к нуклеофильному реагенту, т. е. к соответствующему спирту.
|
|
+ |
он |
+ |
// |
/ |
|
H3 N -C H -C |
|
|
|
Оон
|
|
|
|
|
|
сн3он |
|
|
|
|
н |
|
|
|
+ |
|
|
НКО+ |
^ |
|
3 |
|
+ |
"О |
|
||
H N -C H -C |
|
|
|
|
||
|
R |
О -С Н 3 |
H3 N - сн -с—о-н |
R +0-C H , |
||
|
|
|
|
R 0-С Н 3 |
I 3 |
|
+ |
н+ + |
н20 |
|
н |
||
|
|
|
|
Более удобным является этерификация в присутствии хлористого тионила по схеме:
§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах |
219 |
||||
|
II |
Г К |
-2 0 |
°С |
|
|
|
СН3ОН + |
SOCI2 |
||
H3C-^HD^S—CI |
г |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
HCI |
|
|
+ |
// |
+ |
HCI + s o 2f |
|
|
bLN -CH —C |
|
|
|||
R |
Ч° С Н 3 |
|
|
|
Омыление метиловых и этиловых эфиров проводят при комнатной тем пературе в водно-спиртовых растворах едкого натра или в смеси NaOH с та кими органическими растворителями, как ацетон, метанол, диоксан. Предпо лагается, что реакция идет по следующему механизму:
II
Z - N H - C H - C - O C b L
*1
'ОН
§ 10.7. Блокирование боковых групп в аминокислотах
Степень блокирования боковых групп - важный вопрос при планирова нии синтеза. Его решение зависит от растворимости индивидуальных пепти дов и от выбора методов конденсации. Боковые функции аспарагина, глута мина, серина, треонина, тирозина, аргинина и гистидина могут оставаться незащищенными (например, при использовании метода активированных эфиров). Боковая аминогруппа лизина, сульфгидрильная группа цистеина, индольный гетероцикл триптофана и боковые карбоксильные группы аспартата и глутамата должны защищаться при любой стратегии синтеза.
Полное блокирование всех функциональных групп, т. е. максимальная защита, оптимально способствует предотвращению нежелательных побоч ных реакций и обеспечивает свободу выбора методов конденсации. Однако некоторые используемые в настоящее время защитные группы вызывают та кой нежелательный эффект, как понижение растворимости крупных пепти дов в органических растворителях. В то же время одно из главных преиму ществ минимальной защиты, особенно важное для промышленного произ водства пептидов и для синтеза крупных пептидов и белков, состоит в боль шей легкости удаления небольшого количества защитных групп при получе нии желаемого свободного пептида в конце синтеза.