4 курс / Акушерство и гинекология / Морозова_К_В_Полиморфизм_генов_ферментов_детоксикации,_антиоксидантной

*Разница статистически достоверна, р< 0,05.

Рис.20. Распределение генотипов rs 1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток при потере беременности на сроке 10 недель.

Генотип G/G наблюдался у 4,39% (n=4) женщин с НБ на сроках 10 недель и более, тогда как среди здоровых женщин выявлен всего у одной пациентки (χ² =4,1, р=0,04). Установленная разница оказалась статистически достоверной, что позволяет рассматривать генотип G/G как неблагоприятный (Рис.20).

При сравнении подгруппы пациенток с репродуктивными потерями на сроке более 10 недель и группы здоровых женщин выявлен аддитивный эффект: χ² =4,9, р=0,02. Таким образом, аллель G оказывает негативное влияние на вынашивание беременности и у носителей гетерозиготного генотипа.

При оценке рисков установлено, что носительство аллеля G, по сравнению с аллелем С, в 1,72 раза повышает шанс потери беременности на сроках более 10 недель (OR=1,72, р=0,04, 95%, df= 0,34 – 0,99).

Что касается экстрагенитальной патологии, то нами также выявлена ассоциация носительства аллелей rs 1052133 (С977G) гена OGG1 с развитием анемии во время беременности.

В обеих группах пациенток, как с анемией, так и с нормальным гемоглобином дикий аллель С в гомозиготном состоянии наблюдался с

91

одинаковой частотой 60,57% (n=63) и 71,08% (n=118) соответственно, разница не являлась достоверной (Рис.21).

Что касается гетерозиготного генотипа С/G, тут также не выявлено достоверной разницы по частоте встречаемости среди пациенток с анемией - 32,69 % (n=34) и у здоровых женщин -27,11 % (n=45) (Рис.21).

*Разница статистически достоверна, р< 0,05.

Рис.21. Распределение генотипов rs 1052133 (С977G) гена OGG1 у пациенток с анемией во время беременности.

Минорный аллель G в гомозиготном состоянии выявлен у 6,73% (n=7) пациенток с анемией и всего у 1,08% (n=3) здоровых женщин, что было статистически достоверным: χ² =4,35, р=0,03(Рис.21).

При сравнении групп выявлен аддитивный эффект, то есть, оба генотипа С/G и G/G являются рисковыми по развитию анемии во время беременности. Также установлено, что носители аллеля G имеют повышенный шанс развития анемии во время беременности в 1,65 раз

(OR=1,65, р=0,04, 95%, df= 0,38 – 0,96).

92

4.3 Частоты встречаемости аллелей генов NRF2, CAT, SOD2, GPX4,

беременности.

В организме человека постоянно происходит образование и накопление активных форм кислорода (АФК), как побочных продуктов многих внутриклеточных химических реакция. При нормальной концентрации АФК участвуют в регуляции важнейших функций клетки, таких как процессы митоза, метаболизм молекулы ДНК (35). Однако, в условиях чрезмерной продукции АФК либо при недостаточности нейтрализующей их системы происходит развитие окислительного стресса

(35).

Известно, что процесс перекисного окисления липидов, сопровождающийся образованием свободных радикалов, усиливается в условиях окислительного стресса (25, 81). Неконтролируемое накопление АКФ и свободных радикалов влечет за собой дисбаланс молекулярнохимических систем организма и может приводить к структурным повреждениям в молекуле ДНК, индуцируя мутагенез (25).

Другим мощным негативным фактором, нарушающим нормальный клеточный состав, является воздействие ксенобиотиков (29). В условиях современного мегаполиса с повышенной концентрацией в окружающей среде различных чужеродных химических веществ организм находится под постоянным воздействием вредных соединений, особенно при неполноценности эндогенных защитных систем (44).

Клетки органов и тканей человека обладают высокой чувствительностью к изменению своего гомеостаза и способны быстро реагировать на попадание в ее внутриклеточное пространство чужеродных соединений (свободные радикалы, ксенобиотики), с последующей их нейтрализацией (44). Попавшие в клетку гидрофобные соединения

93

нуждаются в предварительном превращении их в водорастворимую форму, на этом этапе работают ферменты первой фазы детоксикации, однако, если вредоносное вещество исходно водорастворимо, в реакцию сразу вступают ферменты второй фазы системы детоксикации (33). В ходе третьей фазы происходит элиминация из клетки чужеродных агентов. Основным регулятором второй фазы ответа клетки на окислительный стресс является транскрипционный белок NRF2 (34). Вне опасности количество NRF2 находится на низком уровне и преимущественно локализуется в цитозоле, а не в ядре клетки, однако в условиях нарастания оксидантного стресса количество NRF2 резко увеличивается. NRF2 обуславливает активную транскрипцию генов антиоксидантной системы и синтез ферментов, осуществляющих нейтрализацию и элиминацию чужеродного соединения

(35).

Во время беременности происходит значительная перестройка многих химических и метаболических процессов, увеличивается количество ненасыщенных жирных кислот, являющихся основным субстратом для перекисного окисления липидов (36).

Вслучае дисбаланса в антиоксидантной системе происходит избыточное накопление свободных радикалов и АФК, что может пагубно влиять на функциональное состояние матери и плода. Неполноценная элиминация ксенобиотиков также приводит к нарастанию нагрузки на клетки организма, что может сопровождаться нарушением их структуры и функций

(34).

Влитературе существуют упоминания о полиморфных вариантах гена NRF2, носительство аллелей которых приводит к нарушению транскрипции защитных ферментов, что сопровождается повышенной уязвимостью организма в условиях оксидантного стресса и высоких концентраций ксенобиотиков (89, 108, 162).

Объектом нашего исследования выбран ранее не изученный в контексте НБ однонуклеотидный полиморфизм rs 6721961 гена NRF2, при

94

котором происходит замена гуанина на тимин в 617 позиции, что сопровождается выработкой недостаточного количества транскрипционного фактора с последующим дефектом экспрессии необходимых защитных генов ферментов антиоксидантной системы. Относительно общепопуляционных показателей среди европеоидов известно, что аллель G встречается в 89% наблюдений, остальные 10% приходились на аллель Т (108).

Нами проведено генотипирование пациенток с потерей беременности и здоровых женщин с выполненной репродуктивной функцией.

Наиболее часто встречающимся являлся аллель G в гомозиготном состоянии, в основной группе он выявлен у 69,50% (n=105) испытуемых, в контрольной группе этот показатель был несколько выше и составил 73,77 % (n= 90), что достоверно не отличалось.

На втором месте по распространенности оказался гетерозиготный генотип G/T, который выявлен примерно с равной частотой как в основной группе - 29,1% (n=44), так и в контрольной - 23,77% (n=29), достоверная разница между группами также не была установлена.

Самым редким оказался аллель Т rs 6721961 в гомозиготном состоянии. В обеих группах он встречался крайне редко и среди женщин с невынашиванием беременности составил всего 1% (n=2), в контрольной группе генотип Т/Т выявлен также всего у 3 пациенток – в 2% наблюдений.

Согласно результатам нашего исследования, не установлено корреляции между репродуктивными потерями первой половины беременности и носительством вариантных аллелей гена NRF2.

Антиоксидантная защита организма осуществляется благодаря многоступенчатому взаимодействию многих ферментов и химических соединений (25, 35).

Среди основных звеньев антиоксидантной защиты можно выделить митохондриальный фермент каталазу (CAT), выработка которого обеспечивает нормальное течение окислительно-восстановительных реакций в организме. Являясь хромопротеидом из группы гидропероксидаз, каталаза

95

расщепляет образующуюся в результате окислительных реакций токсическую перекись водорода до молекулы кислорода и воды (34, 35). Однако, в условиях низкой концентрации перекиси водорода каталаза проявляет также и пероксидазную активность, окисляя полифенолы и низшие спирты. Ген CAT располагается на 11 хромосоме и отвечает за экспрессию фермента, структурные изменения в гене САТ за счет вариантных аллелей могут по-разному влиять на активность вырабатываемого фермента (80). В случае ослабления защитной функции каталазы могут происходить нарушения в редокссистеме всего организма, что особенно неблагоприятно отражается на течении беременности (36).

В нашем исследовании объектом изучения был выбран мало изученный однонуклеотидный полиморфизм в промоторе гена САТ rs 17880664 (Т21А), при котором происходит замена азотистого основания тимина на аденин в 21 позиции (7).

Аллель Т в гомозиготном состоянии встречался у 37% (n=56) пациенток основной группы, среди пациенток контрольной группы он выявлен у 40% (n=48) обследованных, что достоверно не отличалось. Наши результаты примерно соответствовали значениям для популяции европеоидов в целом - около 50 %.

Вклад гетерозиготы Т/А составил в основной группе 52,3% (n=78), в контрольной этот показатель оказался несколько ниже и составил 45% (n=54), однако достоверных различий также выявлено не было. Частота встречаемости данного генотипа в популяции европеоидов так же находится на уровне 40% .

Самым редким по распространенности среди обследованных нами пациенток был гомозиготный генотип А/А, крайне редко встречающийся и в популяции в целом. У пациенток с невынашиванием беременности он наблюдался в 10 % (n=15) случаев, тогда как в контрольной группе аллель А в гомозиготном состоянии выявлен у 15 % (n=18), разница не была статистически достоверна.

96

Таким образом, по результатам проведенного исследования мы не обнаружили взаимосвязи между носительством аллелей rs 17880664 гена САТ и риском невынашивания первой половины беременности.

Другим важным звеном антиоксидантной защиты организма в условиях оксидантного стресса является фермент глутатионпероксидаза (ГП). Основными ее локализациями являются цитозоль клетки и митохондрии. Глутатионпероксидаза препятствует образованию свободных радикалов посредством восстановления перекиси водорода до воды, а также восстановления органических гидропероксидов до гидроксипроизводных. Поскольку глутатионпероксидаза является гомотетрамерным селенопротеином, активность фермента напрямую зависит от концентрации селена в организме. В условиях современной жизни в мегаполисе с неблагоприятной экологией и нерациональным питанием с редким употреблением в пищу морепродуктов, возникает дефицит поступления в организм селена, что само по себе снижает активность глутатионпероксидазы.

В литературе описано несколько изоформ фермента, кодирующихся разными генами. Ферменты различаются в зависимости от места расположения в клетке и от субстратной специфичности. Наиболее изученным является глутатионпероксидаза 4, играющая основную роль в пероксидации липидов в организме.

Ген глутатионпероксидазы 4 (GPx4) располагается на 19 хромосоме. Известно, что полиморфные варианты гена могут обуславливать синтез белка с измененной антиоксидантной активностью.

Объектом нашего исследования был выбран наиболее изученный полиморфный вариант rs 713041 (С44Т) гена GPx4, при котором возникает замена цитозина на тимин в 44 сайте, что сопровождается экспрессией фермента глутатионпероксидазы 4 с пониженной активностью. По данным литературы, данный вариантный аллель гена ассоциирован с повышенным риском развития некоторых соматических заболеваний (99, 122).

97

Нам представлялось интересным проследить взаимосвязь между носительством данного полиморфизма и риском репродуктивных потерь первой половины беременности.

В популяции европеоидов генотипы rs 713041 распределились следующим образом: гомозиготный генотип С/С встречался у 31,9 %, гетерозиготы С/Т наблюдались у 45% и гомозиготный вариант Т/Т выявлен всего у 23% населения.

В результате генотипирования пациенток обеих групп установлено, что у женщин с невынашиванием беременности аллель С в гомозиготном состоянии встречался в 46,4 % (n=66) наблюдений, в контрольной группе данный генотип выявлен у 38,01% (n=46), что достоверно не различалось.

По распространенности гетерозиготы С/Т между пациентками основной и контрольной групп также не выявлено достоверной разницы, данный генотип выявлен у 38,70% (n=55) и у 51,23% (n=62) соответственно.

Что касается гомозиготного генотипа Т/Т, то у пациенток с репродуктивными потерями он встречался в 15 % (n=21), тогда как среди здоровых женщин выявлен всего у 11% (n=13), однако достоверной разницы не наблюдалось.

Таким образом, достоверных различий по частоте встречаемости аллелей rs 713041 (Т21А) гена GPX4 у пациенток основной и контрольной групп в нашем исследовании установлено не было, и показатели совпали с общепопуляционными. На основании полученных нами результатов можно сделать вывод об отсутствии взаимосвязи между носительством аллелей rs 713041 и риском репродуктивных потерь.

Другой группой наиболее активных ферментов антиоксидантной системы являются ферменты семейства супероксиддисмутаз (СОД) (25). Основной функцией этих металлоферментов является регуляция уровня О2 в клетке посредством реакции дисмутации супероксидных радикалов, в результате которой происходит образование перекиси водорода и воды. Супероксиддисмутаза является чрезвычайно распространенным ферментом,

98

находящимся в клетках всех аэробных организмов (20). В организме СОД представлена тремя изоформами, различающимися по входящему в состав иону металла и располагающимися в различных частях клетки организма, а также во внеклеточной жидкости (35).

Наиболее активной изоформой супероксиддисмутаз является СОД 2, имеющая в своем составе молекулу марганца Mn в активном центре и располагающаяся преимущественно в митохондриях. СОД2 осуществляет защиту организма от активных форм кислорода, постоянно образующихся в результате процессов перекисного окисления липидов (35). Ген SOD2, кодирующий супероксиддисмутазу, локализуется на 6 хромосоме и обеспечивает экспрессию полноценно функционирующего фермента (80). Ряд вариантных аллелей гена SOD2 может быть ассоциирован с изменением количества/активности/стабильности соответствующего фермента.

В нашем исследовании мы провели изучение наиболее описанного однонуклеотидного полиморфизма гена SOD2 - rs 4880 (Т47С). Данный полиморфный вариант характеризуется заменой тимина на цитозин в 47 сайте, который приводит к изменению в первичной структуре белка с заменой аминокислоты аланина на валин со снижением, в той или иной степени, активности кодируемого фермента (93, 161).

Данный полиморфный вариант наиболее изучен и рассматривается как предиктор развития многих мультифакториальных заболеваний (62, 82, 161). Носительство минорного генотипа С/С сопровождается экспрессией фермента с уменьшенной антиоксидантной активностью (82).

По результатам проведенного нами генопитирования установлено, что

показатель составил 20% (n=24), что достоверно не отличалось. В популяции гомозигота Т/Т выявлена у 35 % европеоидов. По данным разных авторов (82, 93, 161), данный генотип рассматривается как благоприятный, поскольку обеспечивает экспрессию активной формы фермента СОД 2.

99

Частота гетерозиготы C/Т у женщин с невынашивание беременности составила 53,6 % (n=81), что оказалось идентичным контрольной группе - 56 % (n=69). В нашем исследовании генотип С/Т выявлен с той же частотой, что и в целом в популяции – около 50%. Изменения активности фермента для гетерозиготы С/Т, по сравнению с гомозиготой Т/Т, по литературным данным не зарегистрировано.

Последний, наименее распространенный генотип С/С в популяции европеоидов встречается у 15 %.

По мнению ряда авторов (82, 156, 161), данный генотип расценивается как неблагоприятный и ассоциирован с продукцией фермента со сниженной антиоксидантной активностью. Однако, по результатам нашего исследования частота встречаемости аллеля С в гомозиготном состоянии у пациенток с невынашиванием беременности составила 21,9 % (n=33), что достоверно не отличалось от группы контроля 23,6% (n= 29).

Таким образом, можно утверждать, что носительство аллелей rs 4880 гена SOD 2 не повышает риск потери первой половины беременности.

Еще одним из важнейших звеньев АОС является восстановленный глутатион (низкомолекулярный тиол), при участии которого происходит восстановление и изомеризация дисульфидных связей, а также изменение активности ферментов и других белков (35). Глутатион является кофактором фермента глутатионпероксидазы, а также при его участии происходит синтез лейкотриенов в организме. Синтез глутатиона происходит под воздействием фермента глутаматцистеинлигазы (GCL), состоящей из двух субъединицрегуляторной субъединицы (GCLM) и обеспечивающей каталитическую

полиморфного варианта rs17883901 ( С129Т) гена GCLC, при котором происходит замена цитозина на тимин в 129 позиции (100).

По результатам генотипирования пациенток выявлено превалирование аллеля С в гомозиготном состоянии в обеих группах. В основной группе

100