Цитология (Э.К.Гасымов)
.pdf31
Для четкого обнаружения элементов гликокаликса не только на светоптическом, но даже и на электронномикроскопичеком уровне, необходимо использование специальных лектинов, рутениума красного и альцианового синего.
Функции клеточной мембраны
Клеточная мембрана создает условия для образования барьера между цитоплазмой и окружающей средой, для способности различных поверхностей одной клетки иметь различные физические свойства и химический состав, для возможности выполнения разнообразных функций, различающихся своими механизмами действия. В обобщенном
виде можно выделить пять основных функций клеточной мембраны:
1.Избирательная проницаемость;
2.Эндоцитоз;
3.Экзоцитоз;
4. Восприятие |
раздражений |
различного |
происхождения |
и |
начало |
5.соответствующих им внутриклеточных процессов (рецепторная функция);
6.Взаимная связь с клеточными и внеклеточными элементами (сведения об этом можно получить в учебнике общей гистологии.)
Избирательная проницаемость
Большая часть молекул, необходимых для деятельности клетки, не способна свободно проходить сквозь плазмолемму. Причиной этого является биологический барьер, созданный гидрофобными частями цепей жирных кислот фосфолипидов в составе плазмолеммы. Поэтому, жирорастворимые газы (О2, N2), гидрофобные молекулы (бензол, некоторые витамины и гормоны), а так же нейтральные гидрофильные молекулы маленьких размеров (вода, этиловый спирт, глицерин, мочевина) способны свободно проходить сквозь плазмолемму (рис.2.12).
Рис. 2.12. Особенности проницаемости фосфолипидного слоя клеточной мембраны.
32
1- газы; 2- гидрофобные молекулы; 3- нейтральные гидрофильные молекулы; 4- молекулы больших размеров; 5- заряженные молекулы и ионы
Процесс, при котором вышеуказанные молекулы свободно проникают внутрь клетки или в обратном направлении, в зависимости от разницы концентрации с обеих сторон плазмолеммы (от места с большей концентрацией к месту с меньшей) называется простой диффузией (рис.2.13.-1).
Наряду с этим, нейтральные молекулы (не несущие заряд) и имеющие молекулярную массу
выше, чем 150кД [1Д (дальтон) = 1,6605 10-24 грамм], (напр. глюкоза, сахароза) и молекулы несущие заряд, независимо от их массы, в т.ч. ионы (H+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,Cl-, HCO3-) не могут преодолевать
барьер плазмолеммы (рис.2.12).
Исследования, проведенные в 30х годах прошлого века, показали, что указанные молекулы и ионы все же могут проникать сквозь плазмолемму внутрь клетки и в обратном направлении в зависимости от разности концетрации и потенциала, причем с большей скоростью по сравнению с простой диффузией. Принимая во внимание эти фактические данные, стал использоваться термин - облегченная диффузия. Во время облегченной диффузии, в отличие от простой, молекулы и ионы, проникающие сквозь плазмолемму, не вступают в непосредственную связь с биологическим барьером, образованным фосфолипидными слоями, а проникают внутрь клетки и в обратном направлении с помощью специализированных интегральных белков (рис 2.13.-2,3).
Рис. 2.13. Виды пассивного(А) и активного (В) транспорта.
1- Обычная диффузия; 2- канал-опосредованная диффузия; 3- диффузия при помощи транспортных белков; 4- активный транспорт при помощи насоса; 5- активный транспорт за счет градиента концентрации
33
Если в процессе простой и облегченной диффузии ионы и молекулы перемещаются сквозь плазмолемму со стороны большего электрического заряда (потенциала) или большей концентрации в сторону меньшего, то такое перемещение называется пассивным транспортом (рис.2.13 – 1,2,3).
Если ионы и молекулы проникают сквозь клеточную мембрану в обратном (от малого к большему) направлении разницы потенциала и концентрации, то такой процесс, не зависимо от его механизма, носит название активного транспорта. Данный процесс осуществляется непосредственно с помощью энергии, образованной во время гидролиза макроэргических молекул [аденозинтрифосфат (АТФ) или гуанозинтрифосфат (ГТФ)] и называется первичным активным транспортом, а белки участвующие в этом процессе называются насосами (рис.2.13 - 4).
Если активная проницаемость осуществляется посредством белков-переносчиков благодаря энергии, высвободившейся в результате образования электрохимического градиента (разницы) в
процессе |
деятельности |
насосов, то такой процесс |
называется |
вторичной активным транспортом |
|
(рис.2.13 - 5). |
|
|
|
|
|
Белки, которые |
обеспечивают |
облегченную |
диффузию, происходящую без затрат энергии |
||
(пассивно), а также участвующие во вторичном |
активном |
транспорте называются белками- |
|||
переносчиками (рис.2.13 – 3,5). |
|
|
|
||
В |
составе плазмолеммы, |
наряду с |
насосами |
и белками-переносчиками, была |
обнаружена третья группа белков, которая участвует в переносе ионов, молекул воды и глицерина. Называются они соответственно ионными и водными каналами.
Таким образом, белки плазмолеммы, обеспечивающие ее избирательную проницаемость и имеющие свойственные им особенности, можно разделить на три большие группы:
1.насосы;
2.каналы;
3.переносчики.
Насосы
Большинство насосов обеспечивающих перемещение ионов и молекул против разницы концентрации и потенциала (более чем в 100 раз) являются ферментами, с АТФ-азной активностью. В данный момент, в эукариотических клетках, различают следующие АТФ-азы:
АТФ-азы Р-типа АТФ-азы F-типа АТФ-азы V-типа
АТФ-азы АВС-типа (АТФ Соединяющие Кассеты)
АТФ-азы Р- типа
К АТФ-азам Р-типа относятся:
Na+/K+ - АТФ-азы, находящиеся на клеточной мембране всех живых существ
Са2+ - АТФ-азы, находящиеся в составе биомембран плазмолеммы и эндоплазматической сети. Н+/К+ - АТФ-азы, находящиеся в составе плазматической мембраны клеток желудка и почек. Na+/K+ насосы были обнаружены Скоу в 1957-ом году во время изучения влияния некоторых
катионов на периферические нервные АТФ-азы. Несмотря на то, что данное открытие не было в свое время достойно оценено (Скоу благодаря этому открытию стал лауреатом Нобелевской премии лишь спустя 40 лет), дальнейшие исследования показали, что большинство процессов, протекающих в клетке,
34
происходят благодаря энергии трансмембранного потенциала (электрохимического), образующегося в результате деятельности Na+/K+ насосов (рис.2.13 - 5).
Na+/К+-АТФ-азы будучи интеграль-ными белками, состоят из α-субъединицы и β-гликопротеина. Необходимые для деятельности насоса АТФ, Na+ и К+ катионы, а так же подвергающиеся процессу фосфорилирования остатки аспарагиновой кислоты, располагаются на α-субъеденице. Процесс присоединения 3Na+ (рис.2.14 -1) к обращенной в сторону цитоплазмы поверхности Na+/K+ насоса является причиной гидролиза молекулы АТФ и фосфорилирования (рис.2.14 -2) α-субъединицы. В результате этого часть насоса, соединенная с Na+, подвергаясь конформационному изменению, переворачивается в сторону наружной поверхности клетки и таким образом обеспечивает выход Na+ из клетки (рис.2.14 -3).
В то же время, присоединение 2К+ к части развернувшейся в сторону наружной поверхности клетки (рис.2.14 -4) является причиной отсоединения фосфатной группы от α-субъединицы (дефосфорилирование) (рис.2.14 -5). Тогда насос, вернувшись в свое первоначальное состояние, обеспечивает перемещение К+ в клетку (рис.2.14 -6). Таким образом Nа+/К+ насос при помощи энергии, высвободившейся в результате гидролиза одной молекулы АТФ, способен переместить 3Na+ - из клетки и 2К+ - в клетку против электрохимического градиента.
Для того чтобы отчетливо показать важность деятельности Na+/K+ насоса, следует отметить выраженную разницу распределения молекул, несущих положительный и отрицательный заряд, в плазмолемме снаружи и внутри клетки (табл. 2.1). Как следует из таблицы, с внешней стороны клеточной мембраны преобладают ионы Na+, Cl- и Са2+, а с внутренней – К+ и органические вещества, несущие положительный заряд (аминокислоты, нуклеотиды, сахара, макромолекулы).
При отсутствии такого равновесия осмотическое давление, создаваемое органическими веществами, стало бы причиной притока жидкости в клетку и нарушения, тем самым ее целостности. Вместе с тем, следует учитывать частые изменения количества органических веществ в клетке в зависимости от протекающих в ней процессов. В таком случае ясно видна роль Na+/K+ насосов в поддержании стабильности объема клетки. Разница, образующаяся при распределении катионов во время работы Na+/K+ насосов, является источником энергии для протекания вторично активного транспорта. Результатом этого является то, что более 25% АТФ, синтезируемых в клетке, расходуется в процессе деятельности Na+/K+ насосов.
Na+/K+ насосы также имеют крайне важную роль при распространении электрических сигналов в нервных и мышечных клетках.
Участие ионов Са2+, как вторичных посредников, в различного рода процессах, идущих внутри клетки, требует поддержания их концентрации внутри цитозоля на очень низком уровне. Это требование осуществляется благодаря находящимся в составе клеточной мембраны Са2+ АТФ-азным ферментам (насосам). Данный насос, имеет схожую с Na+/К+ насосом α-субъединицу и подвергаясь конформационному измене-нию, происходящему благодаря энергии высвободившейся в результате гидролиза одной молекулы АТФ, выводит Са2+ из клетки, а Н+ перемещает внутрь клетки.
Насосы Са2+ аналогичного строения расположены также в стенке саркоплазматической сети мышечных волокон. В результате деятельности данных насосов Са2+, находящийся в цитозоле, перемещается в полость саркоплазматической сети, которая служит для них амбаром, а 2Н+ напротив, перемещается в цитозоль.
35
В результате деятельности данных насосов уровень Са2+ в цитозоле поддерживается в нужном количестве, а Н+, попавший в цитозоль, либо выводится из клетки с помощью белков-переносчиков клеточной мембраны, либо нейтрализуется с помощью систем, играющих буферную роль.
Рис. |
2.14. |
Механизм |
работы |
Na+/K+ |
насоса. |
Описание |
в |
тексте. |
Следует отметить, что в случае резкого изменения концентрации Са2+ в цитозоле, насосы Са2+ в противовес указанному выше механизму начинают активно синтезировать АТФ.
Н+/К+ АТФ-азы играют важную роль в синтезе соляной кислоты в составе желудочного сока. В результате деятельности данных насосов, находящиеся в клетке ионы Н+ замещаются на располагающиеся вне клетки ионы К+. Это происходит на апикальной поверхности париетальных клеток, входящих в состав желез слизистого слоя желудка. Данный электронейтральный обмен является причиной поддержания постоянного уровня кислотности париетальных клеток и резкого увеличения уровня кислотности желудочного сока (РН=2,0). Н+/К+ насосы по своему строению так же состоят из α- и β- субъединиц.
АТФ-азы F -типа
АТФ-азы F -типа встречаются во внутренней оболочке митохондрий эукариотической клетки и представлены в большинстве учебников как АТФ-синтетаза. АТФ-синтетазы F-типа состоят в основном из двух частей:
1.Обращенная в сторону матрикса митохондрий гидрофильная глобулярная часть, состоящая из α- и β-субъедениц. 2.Часть, находящаяся во внутренней оболочке, осуществляющая пассивное перемещение Н+ в матрикс.
36
Рис.2.15. Схема строения фермента АТФ-синтетазы, располагающегося на внутренней мембране митохондрий [Составленно на основе информаций Т.Элстона, Г.Ванга и Дж.Остера (Nature, 1998, 391 p.510-513)].
Эти части соединены друг с другом с помощью ϒ-субъеденицы. Во время перемещения Н+ из межмембранного пространства в матрикс, ϒ-субъединица, вращаясь, подвергает конформационному изменению β-субъединицу, которая при этом синтезирует АТФ путем присоединения РО4 к АДФ (рис 2.15). Если же АТФ, связанная с α-субъеденицей, подвергается гидролизу, то Н+, находящийся в матриксе, может активно перемещаться в межмембранное пространство. Таким образом, АТФ-азы F- типа осуществляют свою работу в качестве насоса.
АТФ-азы V-типа
АТФ-азы V-типа, как следует из их названия, находятся в составе оболочки окружающей вакуолоплазму в цитоплазме. Кроме того, АТФ-азы V-типа находятся в составе плазмолеммы клеток, создающих вокруг себя кислую среду (остеокласты, макрофаги и т.д.).
Основная функция данных АТФ-аз состоит в регулировании кислотности, необходимой для протекания ферментативных процессов в соответствующих органеллах и обеспечение сочетанного перемещения Н+ с помощью энергии, создаваемой градиентом концентрации (напр. проникновение некоторыхнейромедиатороввсинаптическиепузырьки).
Несмотря на схожесть строения АТФ-аз V-типа с АТФ-азами F-типа (рис.2.15), они не способны принять участие в синтезе АТФ, а лишь являютя протонными насосами (во время гидролиза 1 молекулы АТФ в вакуолоплазму поступает 1 или 2 Н+).
АТФ-азы АВС-типа
АТФ-азы АВС-типа (АТР Binding Cassette - АТФ соединяющие кассеты) -наиболее часто встречающиеся во всех живых организмах насосы. Они отличаются как по своим функциям, так и по
37
своему строению от АТФ-аз P-, F- и V-типа. Основным отличием их строения является наличие не одного, а двух мест соединяющихся с АТФ (рис.2.16). Поэтому их называют АТФ соединяющие кассеты.
Основное функциональное отличие заключается в том, что в результате деятельности данных насосов обеспечивается перемещение из клетки, либо в некоторые органеллы не протонов, а ионов и молекул (сахара, аминокислоты, полисахариды, дипептиды, липиды, стероиды и даже некоторые белки).
Рис.2.16. Схема строения АТФ-азы АВС-типа (АТФ соединяющей кассеты).
Впервые АТФ-азы АВС-типа были обнаружены во время исследований в клетках злокачественных опухолей. Было определено, что часть данных клеток погибает под воздействием токсического действия лекарственных препаратов, в то время как другая часть клеток в тех же условиях сохраняет свою целостность и продолжает свою деятельность. После подтверждения наличия в цитоплазме клеток второй группы специфического гена, участвующего в синтезе белков АВС-типа, его стали именовать геном устойчивости к различным лекарственным средствам (MDR – multidrug resistence gene).
Внастоящее время насос, именуемый MDR-1 и синтезируемый в нормальном состоянии в малом количестве, участвует в выведении чужеродных и опасных образований из клетки. В связи с тем, что в некоторых злокачественных клетках данный насос синтезируется в больших количествах и немедленно выводит лекарственные средства, является причиной отсутствия терапевтического эффекта.
Врезультате проведенных исследований обнаружено, что белки, работающие в дыхательных путях, как каналы Cl-, обеспечивающие перемещение поступивших в цитоплазму белков-антигенов в эндоплазматическую сеть, а также участвующие в синтезе желчи печени и участвующие в создании основы хромосомы, являются АТФ-азами АВК-типа.
КАНАЛЫ
Интегральные белки, принимающие участие в процессах избирательной проницаемости путем облегченной диффузии, делятся по своим морфо-функциональным особенностям на две группы:
1.белки, образующие канал или ионные каналы (рис.2.13 - 2)
2.белки-переносчики (рис.2.13 - 3).
38
Гидрофобные аминокислоты данных белков, вращаясь в ту или иную сторону, образуют связь с цепями жирных кислот молекул фосфолипидов, а гидрофильные аминокислоты, вращаясь к центру, формируют наружную часть гидрофильного отверстия (туннель). (рис.2.13 – 2,3).
Известно, что одна часть ионных каналов, кодируемая более чем 100 генами, способна перемещать в различных направлениях клеточной мембраны лишь один ион, другая часть – несколько ионов или растворенные в воде микромолекулы.
Характерной особенностью ионных каналов является их способность к избирательной проницаемости. Данную особенность можно ясно наблюдать на примере сравнения потенциал-зависимых Na+ и К+ каналов. Известно, что ионы К+ значительно больше по своим размерам (r=0,133) в сравнении с ионами Na+ (r=0,095). Несмотря на это, скорость проведения ионов К+ через К+ канал значительно выше (как минимум в 1000 раз), чем их пропускная способность для ионов Na+. В отличие от обычных гидрофильных отверстий, ионные каналы не всегда пребывают в открытом состоянии (см. далее). В пространственном строении белков, образующих эти каналы, имеется часть, напоминающая дверь, которая лишь при воздействии определенных внутриили внеклеточных сигналов способна, изменив свою форму, привезти каналы в открытое состояние и вновь вернуться в обратную форму. (см. далее).
Учитывая сказанное выше, можно разделить ионные каналы на две группы – открытые каналы и каналы с дверью (открывающиеся/закрывающиеся).
Запирающиеся каналы (каналы «с дверью»)
Среди запирающихся каналов всесторонне изучены К+, Na+, Ca2+ и Cl--каналы.
К+ каналы. Современные представления о строении и механизмах функционирования ионных каналов, обладающих избирательной проницаемостью, наиболее полно сформировались при изучение каналов К+. Не случайно то, что автор множества инноваций в этой области Р.МакКиннон, является одним из двухученых, получившихв2003 годуНобелевскуюпремиювобластихимии.
В результате исследований проведенных Р.МакКинноном и другими авторами было определено, что каналы К+ имеют 4 субъединицы одинакового состава, которые охватывают со всех сторон путь прохождения ионов. На концах субъединиц, обращенных к поверхности клетки, имеется фильтр, обладающий избирательнойпроницаемостью, ана поверхности, обращенной всторону цитоплазмыимеется часть играющая роль двери. Роль фильтра играет гидрофильная полость, имеющая диаметр 0,2 нм и длину
1,2 нм, образованная промежутками между Р-петлями (оранж. |
цвета на рис.2.17), соединяющими |
||||||
α-субъединицы белка между собой. Данная полость всех видов К+ |
каналов выстлана глицин-тирозин- |
||||||
глицин |
последовательностью |
остатков |
аминокислот |
и |
окружена |
со |
всех |
сторон атомами кислорода (на рис.2.17 указ. как черные точки), входящими в состав карбонильной группы (С=О).
39
Рис. 2.17. Схема запирающего K + канала.
1- Ионный канал; 2- клеточная мембрана; 3- фильтр для ионов; 4- запирательный участок; 5- ионы К+; 6- молекулы воды
Как видно из рисунка 2.17, ионы К+ снаружи и внутри фильтра находятся лишь в соединенном с молекулой воды состоянии, а в области фильтра видны лишь дегидратированные К+. Таким образом, если в обычном состоянии К+ образует связи с атомами кислорода в составе воды, то в области фильтра подобные связи он образует с атомами кислорода карбонильной группы аминокислот. Точнее К+, теряя свою водную оболочку (после дегидратации), перемещается внутрь фильтра, вступая в связь с карбонильными группами аминокислот.
Имеется две причины значительно низкой скорости прохождения ионов Na+ по К+ каналам: 1. в связи с маленькими размерами дегидратированных ионов Na+ они не способны создавать необходимые связи с окружающими фильтр карбонильными группами; 2. по причине больших размеров ионов Na+, соединенных с молекулами воды, они не могут размещаться в полости фильтра.
У белков, образующих К+ каналы во внутриклеточной части, имеется специфический сенсорный участок со стороны цитоплазмы, способный воспринимать деполяризацию, являющийся участком соединения с Са2+ , а на части обращенной к наружной стороне клетки – участок соединения с различными лигандами. Сравнительный анализ белков во время открытого и закрытого положений канала показывает, что сенсорные участки, принимая соответствующие раздражения, оттягивают в
40
сторону α- спирали (рис.2.17 указ.стрелкой), расположенные возле цитоплазмы, тем самым приводя канал в открытое состояние.
Калиевые каналы встречаются во всех имеющихся клетках организма. Данные каналы участвуют в образовании мембранного потенциала (потенциал покоя), в регуляции осмотического давления и объема клетки, в модуляции электрических раздражений в нервных клетках и т.д.
При мутационных изменениях в синтезе белков, составляющих К+ каналы, наблюдается существенное снижение уровня ионов К+ в организме и как следствие, удлинение интервала QT на электрокардиограмме, отображающей деятельность сердца (ЭКГ). Причиной этого является запоздалое открытие калиевых каналов во время деполяризации в клетках сердечной мышцы. Тогда, в результате увеличения срока потенциала действия в сердце могут наблюдаться анормальные ритмы сердечного цикла, приводящие в итоге к внезапной смерти.
Na+ каналы по своему строению схожи с К+ каналами. Основное их отличие заключается в том, что они состоят не из отдельных субъединиц, а из одной белковой цепи с молекулярной массой 260 кД. Основной особенностью Na+ каналов является то, что они, открывшись всего лишь на одну или две миллисекунды, вновь возвращаются в закрытое состояние. Между тем первичная деполяризация, необходимая для образования потенциала действия в некоторых видах клеток, в особенности способных принимать раздражение, таких как поперечнополосатая мышечная, нервная, сердечная, возможна лишь при переходе каналов в открытое состояние.
Следует отметить, что врожденная недостаточность синтеза белков натриевых каналов также может являться причиной удлинения интервала QT на ЭКГ. Однако в данном случае появление анормальных ритмов наблюдается в результате запоздалой реполяризации из-за удлинения периода возвращения Na+ канала в неактивное состояние. Местные анестетики (лидокаин, прокаин), которые используются при обычных медицинских операциях, сохраняя каналы Na+ в закрытом состоянии, препятствуют возникновению потенциала действия и тем самым нарушают транспорт болевого импульса в центральную нервную систему.
Са2+ каналы в сравнении с другими катионовыми каналами представлены сложными белковыми комплексами, которые состоят из субъединиц (α, α2, β, ϒ) различного состава и количества. Данные каналы находятся как в клеточной оболочке, так и в оболочке окружающей эндоплазматическую сеть.
Са2+ канал, активирующийся во время деполяризации клеточной мембраны и присоединения лиганда к определенной рецепторной части, обеспечивает перемещение ионов Са2+ в цитоплазму по градиенту концентрации.
Са2+ каналы играют важную роль в регулировании мембранного потенциала, в сокращении мышц, в процессе секреции, в образовании межклеточных связей, в осуществлении в качестве вторичного посредника, различных процессов, идущих в клетке.
Cl- каналы. Это самые распространенные потенциал-зависимые каналы. До настоящего времени среди них обнаружено более 15-ти изомеров. Белки, участвующие в их образовании, состоят из двух субъединиц (димеры).