Книги / Частная бактериология
.pdf81
а б Рисунок 2.2 – Нейссерии, электронная микрофотография (а) и компьютерная
визуализация (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Среди нейссерий встречаются также короткие (0,5 мкм) палочки (диплобациллы), располагающиеся в цепочках (например, Neisseria elongate). Некоторые виды нейссерий имеют капсулу и микроворсинки - пили (рисунок 2.3).
Рисунок 2.3 - Капсула и пили у нейссерий, компьютерная визуализация. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Культуральные свойства нейссерий. Нейссерии являются аэробами.
Оптимальная температура роста 35-37°С, патогенные виды могут расти в интервале температур 24-41°С, а непатогенные виды способны к росту при температурах ниже 24°С. Оптимальное значение рН питательных сред для выращивания нейссерий составляет 6-8. Патогенные виды прихотливы к условиям культивирования, не растут на обычных питательных средах; непатогенные виды менее прихотливы. Для выращивания патогенных нейссерий используют среды с кровью, сывороткой крови, дополнительными факторами роста (сывороточный агар, кровяной агар, шоколадный агар, среда Мак-Конки и др.). Культивирование проводят в атмосфере углекислого газа (5-7%). На плотных питательных средах через 24 часа нейссерии образуют нежные мелкие выпуклые круглые колонии с ровными краями (рисунок
2.4).
82
а б
Рисунок 2.4 - Рост N. subflava на агаре Мак-Конки (а) и на колумбийском шоколадном агаре (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Ферментативная активность нейссерий низкая. Они продуцируют каталазу (за исключением Neisseria elongata) и цитохромоксидазу, ферментируют некоторые углеводы с образованием кислоты. Многие виды нейссерий редуцируют нитриты, некоторые - восстанавливают нитраты. Отличительные признаки бактерий рода Neisseria представлены в таблице 2.1.
Таблица 2.1 - Основные дифференциально-диагностические свойства нейссерий
Вид |
|
|
|
|
|
Ферментация |
|
Образование полисахарида на среде с 5% сахарозы |
Редукция** |
|||
|
Рост на агаре без сыворотки |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Зависимость роста от СО |
Желтый пигмент |
глюкозы |
мальтоза |
|
сахароза |
фруктоза |
лактоза |
нитратов |
нитритов |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N. |
- |
+ |
- |
к |
- |
|
- |
- |
- |
- |
-**** |
-**** |
gonorrhoeae |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N. |
- |
+ |
- |
к |
к |
|
- |
- |
- |
- |
-**** |
-**** |
meningitidis |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
N. subflava |
+/* |
- |
+ |
к |
к |
|
к/- |
к/- |
- |
-/+ |
- |
+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
*** |
|
|
N. flava |
+/- |
- |
+ |
- |
- |
|
- |
- |
- |
+ |
- |
+ |
N. mucosa |
+ |
- |
+/- |
к |
к |
|
к |
к |
- |
+ |
+ |
+ |
N. sicca |
+/- |
- |
+/- |
к |
к |
|
к |
к |
- |
+ |
- |
+ |
N. lactamica |
+ |
- |
+ |
к |
к |
|
- |
- |
к |
- |
- |
+ |
Примечание:
* Биовар N. perflava не растет на бессывороточном агаре.
83
**Тест используется только для дифференциации условно-патогенных
нейссерий.
***Биовар N. perflava имеет положительную реакцию.
****Некоторые штаммы редуцируют нитриты в низких концентрациях
(0,01%).
Антигенная структура. Все виды нейссерий имеют полисахаридный соматический О-антиген. Штаммы, образующие капсулу, также имеют капсульный антиген. В клеточной мембране патогенных нейссерий содержится нейссериальный поверхностный белок А (NspA).
Резистентность. Во внешней среде патогенные нейссерии не устойчивы. В связи с этим исследуемый материал доставляют в лабораторию в транспортных средах (транспортная среда для нейссерий, среда Эймса) в термоконтейнерах, обеспечивающих температуру 30-35°С. Нейссерии чувствительны к действию многих антисептиков и дезинфектантов. Они обладают высокой чувствительностью к пенициллинам, тетрациклинам, стрептомицину и другим антибиотикам. Однако в последнее время все чаще в клинической практике встречаются штаммы нейссерий, устойчивые к антибиотикам.
2.1. Менингококки
Менингококковая инфекция - это острое инфекционное заболевание человека, вызываемое Neisseria meningitidis и характеризующееся локальным поражением слизистой оболочки носоглотки с последующей генерализацией процесса в виде менингококковой септицемии (менингококцемии или менингококкемии) и воспаления мягких мозговых оболочек (менингококкового менингита, эпидемического цереброспинального менингита).
Первые клинические описания менингококкового менингита представили английские врачи Т. Уиллис (Вилизий) и Т. Сиденхэм (рисунок 2.5).
А Б
Рисунок 2.5 – А - Томас Уиллис (Thomas Willis, 1621 – 1675 гг.); Б - Томас Сиденхэм (Thomas Sydenham, 1624 – 1689 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Возбудитель менингита обнаружил в спинномозговой жидкости больного и детально описал в 1887 г. австрийский бактериолог А. Вайхзельбаум (рисунок 2.6).
84
Рисунок 2.6 - Aнтон Вайхзельбаум (A. Weichselbaum, 1845 – 1920 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Таксономия. Вид Neisseria meningitidis относится к семейству Neisseriaceae
роду Neisseria. В составе этого вида по капсульным полисахаридным антигенам выделяют 13 серогрупп (A, B, C, D, X, Y, Z, W и др.). По белковым и полисахаридным антигенам клеточной стенки выделяют 20 сероваров или серотипов. Наиболее частыми возбудителями генерализованной менингококковой инфекции являются серогруппы A, B и C.
Морфологические и тинкториальные свойства. Менингококки имеют округлую форму диаметром 0,6-1,0 мкм, располагаются попарно. Поверхности, обращенные друг к другу, вогнутые или ровные (рисунок 2.7).
Рисунок 2.7 - Менингококки в препарате, компьютерная визуализация. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Менингококки по Граму окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). В мазках часто наблюдается неравномерное окрашивание: молодые клетки окрашиваются интенсивно, а старые клетки воспринимают краситель очень слабо (рисунок 2.8).
Рисунок 2.8 - Чистая культура N. meningitidis. Окраска по Граму. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
85
Клеточная стенка менингококков содержит липоолигосахарид (ЛОС), состоящий из липида А и олигосахарида. ЛОС отличается от липополисахаридов (ЛПС) других грамотрицательных бактерий отсутствием разветвленных углеводных О-боковых цепей (рисунок 2.9).
О-боковая цепь |
Ядро |
Липид А |
ЛПС
ЛОС
Рисунок 2.9 – Сравнительная структура липополисахарида (ЛПС) и липоолигосахаридов (ЛОС).
По структуре ЛОС напоминает гликосфинголипид клеточной мембраны организма, поэтому микроб “маскируется” от действия защитных факторов макроорганизма. Кроме того, ЛОС-эндотоксин содержит нейраминовую (сиаловую) кислоту, что обеспечивает устойчивость менингококков к комплементу (блокирование альтернативного пути активации комплемента).
Менингококки не имеют жгутиков, спор не образуют. Они способны образовывать пили и капсулу (рисунок 2.10).
Рисунок 2.10 – Капсула и пили N. meningitidis. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Культуральные свойства. Менингококки являются строгими аэробами и капнофилами. Они очень требовательны к условиям культивирования и хорошо растут в присутствии 5-7% углекислого газа. На простых питательных средах менингококки не растут, для их культивирования используют среды, содержащие кровь, сыворотку крови, яичный желток, аминокислоты, витамины. Оптимальное значение рН среды составляет 7,2-7,4. Оптимальная температура выращивания 37°С. На плотной питательной среде менингококки образуют полупрозрачные
86
нежные колонии с ровными краями и блестящей поверхностью (S-форма) диаметром 0,5-1,5 мм. На кровяном агаре формируются полупрозрачные сероватые колонии маслянистой консистенции без зоны гемолиза (рисунок 2.11).
Рисунок 2.11 – Рост менингококков на кровяном агаре. Заимствовано из Интернетресурсов.
Встолбике 0,1% полужидкого сывороточного агара менингококк вызывает интенсивное помутнение в верхней части столбика.
Всывороточном бульоне менингококки вызывают гомогенное помутнение ближе к поверхности среды.
Биохимическая активность менингококков низкая. Они разлагают глюкозу
имальтозу до кислоты без газа (рисунок 2.12), не разжижают желатин, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты.
Глюкоза |
Мальтоза |
Лактоза |
Сахароза |
Рисунок 2.12 – Разложение углеводов менингококками.
Антигенная структура. По капсульным антигенам менингококки подразделяются на 13 серологических групп (А, В, С, D, 29-Е, Н, I, К, L, X, Y, Z, W- 135). Наиболее часто от больных выделяют серогруппы А, В и С. Штаммы серогруппы А вызывают эпидемические вспышки, а штаммы серогрупп В и С выделяются при спорадических заболеваниях.
В клеточной мембране менингококков содержится нейссериальный
видоспецифический поверхностный белок А (NspA) и поверхностные
типоспецифические белки 5 классов (класс 1 - PorA, классы 2 и 3 - PorB, класс 4 - Rmp и класс 5 – Opa и Орс). Часть этих белков выполняет функцию поринов (PorA и PorB). Белки наружной мембраны класса 5 (Ора и Орс) называются белками мутности, так как штаммы, имеющие эти белки, формируют мутные колонии.
На основании типоспецифических белков вид N. meningitidis делят на серотипы (по PorB-белку выделяют 20 серотипов). В свою очередь, по составу
87
белков класса 1 (по PorA-белку) серотипы подразделяются на 10 субтипов. Одни
ите же типовые и субтиповые белки встречаются у менингококков разных серогрупп. Таким образом, антигенный состав каждого штамма включает капсульный групповой полисахарид, типовой белок и субтиповой белок. В практической работе изучение антигенной структуры штаммов ограничивается определением серогруппы, реже – серотипа и субтипа. Типовые и субтиповые антигены используются в качестве эпидемических маркеров штаммов менингококков.
Липоолигосахариды клеточной стенки N. meningitidis в антигенном отношении неоднородны, в результате чего менингококки подразделяются на
иммунотипы (L1, L2, L3 и т. д.).
Кфакторам патогенности менингококков относятся пили, поверхностные белки (белки наружной мембраны), “железо-обеспечивающие” белковые системы, полисахаридная капсула, ЛОС-эндотоксин, гиалуронидаза, нейраминидаза, протеаза
идругие факторы (рисунок 2.13).
Нейраминидаза |
Rmp |
Капсула |
|
|
|
|
|
Ора |
Протеаза |
|
Пили |
Орс
Гиалуронидаза
Por ЛОС
Рисунок 2.13 – Основные факторы патогенности менингококков.
Пили обеспечивают адгезию возбудителя к слизистой оболочке носоглотки. За адгезию и поверхностную колонизацию носоглоточного эпителия отвечает концевой ассоциированный с пилями белок PilC. Рецептором для этого белка служит CD46, имеющийся на эпителиальных клетках и специфичный только для человека. Белок PilC “оповещает” менингококк об адгезии. В эпителиальной клетке под местом прикрепления PilC происходит перестройка цитоскелета. После получения сигнала от белка PilC о прикреплении бактерии к эпителиальной клетке менингококки убирают пили путем ретракции (сокращения) и утрачивают капсулу. В результате этого происходит непосредственное соприкосновение менингококка своей наружной мембраной с поверхностной мембраной эпителиальной клетки.
Белки наружной мембраны PorA и PorB (порины), Rmp M (reduction modifiable protein), Opa (A, B, D), Opc выполняют у менингококков функции адгезии и инвазии. При этом белки мутности Ора и Орс участвуют в адгезии микробных клеток, а белок Орс является еще и инвазином, отвечающим за проникновение менингококков в эпителиальные клетки. Белки Opa A и D способствуют адгезии бактерий к эпителию и эндотелию путем взаимодействия с рецептором СD66. Белки наружной мембраны PorA и PorB встраиваются в мембрану эпителиальных клеток и образуют ионные каналы. Белок PorB участвует в реорганизации актина эпителиальных клеток, что способствует инвазии микробной клетки.
88
Капсула полисахаридной природы защищает от фагоцитоза менингококки, находящиеся в кровяном русле.
“Железо-обеспечивающие” белковые системы располагаются в наружной мембране менингококков и объединяют белки, конкурирующие за ионы железа:
-лактоферрин-связывающие белки (LbpA и LbpB);
-трансферрин-связывающие белки (TbpA и TbpB);
-гемоглобин-связывающие белки (HbmR и HpuA/B).
Эти белки участвуют в метаболизме железа. У разных штаммов менингококков они различаются по молекулярной массе и свойствам.
Эндотоксин (ЛОС) оказывает выраженное пирогенное и сенсибилизирующее действие, участвует в развитии сосудистых поражений и кровоизлияний во внутренние органы. Результатом этого действия является экзантема в виде характерной геморрагической сыпи. Выраженная токсинемия возникает при размножении менингококков в кровяном русле.
Гиалуронидаза, нейраминидаза и фибринолизин способствуют распространению возбудителя по организму.
Протеаза (IgA-протеаза) расщепляет секреторный иммуноглобулин А в шарнирной области, защищая бактерии от действия антител.
Резистентность. Менингококки слабоустойчивы во внешней среде. Вне организма человека и при низкой температуре они быстро погибают. Поэтому при доставке материала в лабораторию используют не только специальную транспортную среду, но и транспортировочные контейнеры, обеспечивающие заданный температурный режим. При температуре 10°С менингококки погибают через 2 часа, при температуре 55°С - через 5 минут, при 80°С – через 1-2 минуты, при кипячении - моментально. Ультрафиолетовые лучи оказывают на них летальное действие. Менингококки чувствительны к действию большинства антисептиков и дезинфектантов. Под действием 1% раствора фенола, 0,5-1% раствора хлорамина, 70% этанола, 3-5% раствора карболовой кислоты они погибают через 1 минуту. Большинство антибиотиков оказывает на менингококки бактерицидное действие. Однако менингококк обладает естественной резистентностью к ванкомицину, полимиксину, ристомицину, линкомицину.
Эпидемиология. Источником возбудителя при менингококковой инфекции являются больные генерализованными формами (около 1% от общего числа инфицированных лиц), больные назофарингитом (10-20% от общего числа инфицированных лиц) и здоровые носители (80-90% от числа инфицированных). Бактерионосительство у детей 1-2 лет встречается редко, чаще всего носительство отмечается в возрасте 14-19 лет. Бактерионосительство продолжается в течение 2-3 недель. Механизм передачи - аэрогенный, путь передачи - воздушно-капельный. Менингококковый менингит регистрируется в осенне-зимний период.
Менингококковой инфекцией болеют в основном дети до 15 лет (70-80%) и лица юношеского возраста (10-15%). Возникновению вспышек способствует скученность детей в детских организованных коллективах, учащихся в школах, студентов. Уровень заболеваемости зависит от распространенности носительства менингококка: заболевания не регистрируются в коллективах, где носительство составляет 20% и выше. В этих случаях интенсивная циркуляция менингококка обеспечивает “естественную иммунизацию” людей.
89
В настоящее время менингококковая инфекция зарегистрирована более чем в 150 странах мира. В Африке имеется зона высокой заболеваемости менингококковой инфекцией (“менингитный пояс”). Эта зона располагается к югу от пустыни Сахара и распространяется от Эфиопии на востоке до Гамбии на западе. Она включает 15 стран и население более 260 млн. человек (рисунок 2.14).
Эпидемии менингококкового менингита происходят в этих странах через каждые 7-14 лет. В этой зоне регистрируются высокие показатели заболеваемости менингококковой инфекцией. Например, за эпидемический сезон 2009 г. в 14 странах было зарегистрировано 88199 случаев заболевания, из которых 5352 случая закончились летальным исходом.
Рисунок 2.14 - “Менингитный пояс” в Африке. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Заболеваемость менингококковой инфекцией в Российской Федерации за 1998-2002 годы составила 2,7 на 100 тыс. населения, в 2003 г. показатель заболеваемости составил 3,01 на 100 тыс. населения. За 2007-2009 гг. число генерализованных форм менингококковой инфекции по Российской Федерации снизилось с 2246 случаев (1,58 на 100 тыс. населения) до 1795 случаев (1,26 на 100 тыс. населения), а число летальных исходов – с 293 до 239 случаев.
Патогенез менингококковой инфекции включает несколько этапов (рисунок 2.15). На первом этапе менингококки, проникнув в организм человека с вдыхаемым воздухом, попадает на слизистую оболочку носоглотки (входные ворота инфекции). Нейраминидаза способствует продвижению возбудителя через слой вязкой слизи, а IgA-протеаза разрушает секреторный иммуноглобулин А на слизистой оболочке. Затем менингококк с помощью пилей связывается с рецепторами CD46 эпителиоцитов и колонизирует слизистую оболочку. На стадии колонизации возбудитель не образует капсулу. В этот период в месте входных ворот не возникает выраженных морфологических изменений, поэтому процесс называют “здоровым” носительством. В большинстве случаев колонизация длится от 1 недели до 1 месяца и прекращается благодаря действию защитных сил организма.
Большое значение в колонизации слизистых оболочек имеет способность менингококков формировать биопленку. Она состоит из экзополисахаридного волокнистого матрикса и содержит канальцы, обеспечивающие питанием находящиеся в матриксе бактерии. Менингококковая биопленка образуется на поверхности эпителия в течение 12 часов после проникновения возбудителя в организм. Находящиеся в биопленке клетки лишены капсул. Друг с другом бактерии
90
в биопленке сцеплены с помощью пилей. Биопленка защищает микробные клетки от антител, лекарственных препаратов и других неблагоприятных факторов окружающей среды. От поверхностных слоев биопленки периодически могут “отрываться” отдельные бактерии (так называемые планктонные клетки). Такие клетки могут образовывать капсулу. Следовательно, носительство обусловлено как капсульными, так и бескапсульными клетками, временно прекратившими синтез капсульной субстанции.
Менингококковый
назофарингит
Бактериемия (менингококкемия)
Носительство
менингококков
Гнойный
менингит
Рисунок 2.15 – Схема патогенеза менингококковой инфекции.
Примерно у 30-50% бактерионосителей инфекционный процесс переходит в следующий этап – инвазия микробов в подслизистый слой. В этом случае бескапсульные менингококки “убирают” пили и клеточной стенкой соприкасаются с поверхностной мембраной эпителиальной клетки. Затем с помощью поверхностных белков Ора и Орс менингококк прикрепляется к мембране эпителиальных клеток и внедряется в них путем инвагинации (фагоцитоз путем сигналинга). Те менингококки, которые сохранили капсулу, проникают в эпителиальные клетки путем “непрофессионального” фагоцитоза (поглощение бактерии эпителиальной клеткой по механизму эндоцитоза). Проникшие в эпителиальные клетки менингококки стимулируют выброс цитокинов, которые вызывают воспаление слизистой оболочки. Поглощенные менингококки транспортируются сквозь эпителиальную клетку в субэпителиальный слой (трансцитоз). В месте входных ворот (в носоглотке) развивается катаральное воспаление. При этом в кровь проникает эндотоксин, обусловливая интоксикацию организма, которая длится в течение 3-7 дней. Это состояние называется острым менингококковым назофарингитом.
У незначительной части инфицированных лиц менингококк, проникнув в кровь, вызывает бактериемию. Генерализованную инфекцию обусловливают капсульные клетки, имеющие пили. В кровяном русле часть клеток погибает, а другие начинают усиленно размножаться. В результате гибели клеток в кровоток поступает эндотоксин (эндотоксинемия), а быстрое размножение возбудителя приводит к бактериемии. При бактериемии происходит гематогенная диссеминация менингококков в различные органы и системы. В местах оседания возбудителя