12 Диссертация Смолянова

41

предложения по внедрению единиц измерения параметров специфической активности.

Общепринятым показателем уровня специфической нейтрализующей активности против вируса

SARS-CoV-2 на период 2020-2021 годов считался титр в РВН с использованием культуры клеток

Vero или суррогатных методиках вируснейтрализации.

В середине 2021 года появились несколько стандартов ВНА антител, специфичных к

SARS-CoV-2. Так Подкомитетом по эталонным стандартам биологических продуктов Национального комитета по эталонным стандартам ЛП в качестве первого китайского национального стандарта по показателю нейтрализующей активности антител к SARS-CoV-2, с

назначенной эффективностью 1000 единиц на миллилитр (Ед/мл) был одобрен образец крови переболевшего. Разработчики предполагают, что этот стандарт может способствовать стандартизированной оценке качества и эффективности вакцин и терапевтических средств для лечения COVID-19 в Китае [149]. Однако СО в виде одиночного образца может иметь ряд ограничений в случае, когда речь идет о специфическом взаимодействии антител и антигенов.

Далее всемирно организацией здравоохранения (ВОЗ) были начаты инициативы по гармонизации оценки иммунного ответа вакцин-кандидатов против COVID-19, включая Глобальную сеть централизованных лабораторий CEPI3. С целью гармонизации результатов различных клинических испытаний вакцин были разработаны общие стандартные операционные процедуры и рабочий стандарт, откалиброванный по международному стандарту.

Международная контрольная панель для определения антител к SARS-CoV-2 были приняты Комитетом экспертов ВОЗ по биологической стандартизации [150,151].

Международная контрольная панель для определения антител к SARS-CoV-2 ВОЗ

(международная контрольная панель Национального института биологических стандартов и контроля NIBSC 20/268 (First WHO International Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin) содержит несколько образцов NIBSC 20/150 (High), NIBSC 20/148 (Mid), NIBSC

20/144 (Low S, high N), NIBSC 20/140 (Low), NIBSC 20/142 (negative human plasma), которые представляют собой пулированные образцы плазмы реконвалесцентов, содержащие антитела к вирусу SARS-CoV-2, и отрицательный контроль, полученный из плазмы крови здоровых доноров, собранной до 2019 года с назначенной активностью для каждого образца панели (Табл. 1.2) [150]. Для анализов связывания единица связывающего антитела (binding antibody units) на мл (BAU/мл) может быть использована для облегчения сравнения анализов, обнаруживающих тот же класс иммуноглобулинов с той же специфичностью (например, антирецептор-

связывающий домен IgG, анти-N IgM) [151].

42

Таблица 1.2 – Характеристика международной контрольной панели NIBSC 20/268 [148]

Предполагается использование Международной контрольной панели для определения антител к SARS-CoV-2 в качестве стандарта (единицы измерения МЕ и BAU) в серологических анализах с целью повышения достоверности и гармонизации методов диагностики. Так проведенное исследование по внедрению Международной контрольной панели для определения антител к SARS-CoV-2 ВОЗ с участием 44 лаборатории из 15 стран мира с использованием живых и псевдотиповых тестов нейтрализации, ИФА, экспресс-тестов и других методов показали, что межлабораторная вариация сократилась более чем в 50 раз для нейтрализации и в 2000 раз для ИФА, когда значения анализа были представлены относительно международного стандарта

[151].

Таким образом, было разработано и аттестовано несколько стандартов, представляющих собой контрольные панелей, что характеризует их в первую очередь как стандарты для валидации диагностических тест-систем.

Согласно рекомендациям ВОЗ основной задачей получения СО является обеспечение постоянства содержания основного компонента СО в процессе хранения, транспортирования и использования, так как изменение этого параметра СО может снижать точность количественного определения IgG к вирусу SARS-CoV-2 в препаратах иммуноглобулинов человека. Также согласно рекомендации ВОЗ для высокой достоверности результатов определения основного действующего вещества ЛП используют СО, с установленными значениями аттестационных характеристик, по которыми проводят сравнение испытуемых ЛС, идентичные по свойствам,

составу и происхождению исследуемым образцам (принцип «like versus liке») [152].

В связи с этим, очевидно, что применение контрольной панели или стандарта,

представляющего индивидуальный или пулированный образец плазмы, не является целесообразным по причине различных составов и соответственно отсутствия гарантии постоянства состава.

43

Таким образом, для разработки точной и воспроизводимой методики количественного определения специфической активности антител IgG человека к вирусу SARS-CoV-2 для ЛП ИГЧ против COVID-19 получение и аттестация СО является необходимым этапом разработки.

Разработанный метод оценки специфической активности готовой лекарственной формы требуется не только для определения специфической активности в ЛП ИГЧ против COVID-19,

но и для оценки клинической эффективности ЛП при исследовании фармакокинетических свойств.

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 1

1. Появление и распространение новых опасных вирусных инфекций ставит перед учеными мирового сообщества задачу создания эффективных и безопасных ЛП,

предназначенных как для профилактики, так и лечения выявленных заболеваний.

2. К числу перспективных антиковидных ЛП следует отнести специфический иммуноглобулин человека против COVID-19, получаемый из плазмы, содержащей антитела к

SARS-CoV-2.

3. Показатель специфической активности является одним из основных показателей качества ЛП специфических противовирусных иммуноглобулинов. Проведенный анализ литературных данных показал, что этот показатель, как правило, оценивается с применением биологических методов на животных или клеточных культурах, что имеет ряд недостатков,

устранению которых способствует переход на методы in vitro, в частности иммунобиологические.

4.Для оценки уровня специфических антител в исходном сырье, фармацевтической субстанции и ЛП специфического иммуноглобулина против SARS-CoV-2 необходима разработка унифицированной методики.

5.Научный анализ современного состояния проблемы оценки уровня специфических антител против SARS-CoV-2, позволяет сделать заключение о перспективности использования для этих целей РВН на культуре клеток VERO, с последующим переходом на метод ИФА.

6.Проведен анализ современного состояния проблемы стандартизации специфических иммуноглобулинов, определено, что классическим методом определения специфической активности лекарственных препаратов противовирусных иммуноглобулинов является реакция вируснейтрализации, а также установлена тенденция перехода на методы in vitro, с

использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА), в частности для количественного определения антител к SARS-CoV-2.

44

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на базе филиала фармацевтического предприятия АО

«НПО «Микроген» в г. Пермь, «Пермское НПО «Биомед». Анализ вируснейтрализующей активности был проведен в Федеральном государственном бюджетном учреждении

"Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации. Изучение фармакокинетики препарата КОВИД-глобулин проводилась на базе ООО «Центр Фармацевтической Аналитики» (ООО «ЦФА»).

2.1. Материалы

2.1.1. Объекты исследования

Образцы плазмы человека

Объектами исследования стали образцы плазмы человека. Они представляли собой образцы плазмы, полученные путем сбора венозной крови реконвалесцентов в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА для формирования плазмы. Венопункцию проводили согласно действующим на территории РФ стандартам [153-154]. Плазму переносили в чистые пробирки,

аликвотируя на 3 пробирки равного объема.

Препараты Иммуноглобулина человека нормального

Для анализа использовали следующие препараты Иммуноглобулина человека нормального, производства АО «НПО «Микроген»:

- Имбиоглобулин (иммуноглобулин человека нормальный), раствор для инфузий, 50

мг/мл (ЛС-000177);

-Иммуновенин® иммуноглобулин человека нормальный, лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения 50 мг/мл (Р N000296/01);

-Иммуноглобулин человека нормальный (иммуноглобулин человека нормальный),

раствор для инфузий, 50 мг/мл (Р N001594/01);

- Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутримышечного введения, 100

мг/мл (Р N001544/01);

Серии препаратов, использовавшихся в работе приведены в Приложении В.

Препарат Иммуноглобулина человека против COVID-19

Разрабатываемый препарат Иммуноглобулина против COVID-19 представляет собой раствор для инфузии. Наработанные опытно-промышленные партии препарата, использованные в работе (П1, П2, П3 и П4) полностью по критериям качества соответствовали требованиям ГФ РФ [155-157].

45

Вирус SARS-CoV-2

Для постановки РВН использовали вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-

1/2020), полученный из Государственной коллекции вирусов. Паспорт представлен в Приложении Г.

Линии клеток млекопитающих

Для постановки РВН использовали клеточную линию Vero E6 - клетки эпителия почки африканской зеленой мартышки.

2.1.2. Реактивы и материалы

Среды для культивирования клеток

Для культивирования клеточных линий эукариот использовали следующие среды:

• Среда DMEM (минимальная среда Игла, модифицированная Дельбекко, HyClone,

США), содержащая 10% термоинактивированной эмбриональноый телячьей сыворотки

(HyClone, США), глутамин (584 мг/л) и антибиотики пенициллин и стрептомицин (ПанЭко,

Россия) – для наращивания клеток.

•Среда DMEM (минимальная среда Игла, модифицированная Дельбекко, HyClone,

США), содержащая 2% термоинактивированной эмбриональноый телячьей сыворотки (HyClone,

США), глутамин (584 мг/л) и антибиотики пенициллин и стрептомицин (ПанЭко, Россия) – для наращивания вируса и для постановки реакции нейтрализации.

Криохранение клеток осуществляли в растворе среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида для культуры клеток.

Реагенты для РНК и ОТ-ПЦР

Для выделения РНК вируса использовали Реагент для выделения суммарной РНК

ExtractRNA (Евроген, Россия). Для проведения ПЦР использовали набор реагентов OneTube RT-

PCRmix (Евроген, Россия).

Наборы реагентов для определения антител к SARS-CoV-2

1) Набор реагентов для иммуноферментного определения IgG антител к антигену SARS- CoV-2 в сыворотке (плазме) крови "SARS-СоV-2-IgG-ИФА", производитель ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ (РЗН 2020/10219 от 30.04.2020), Россия (далее - ИФА ГНЦ), (инструкция – см. Приложение Д). В качестве антигена в данной тест-системе используется рецептор-

связывающей домен (RBD) домен S белка коронавируса SARS-CoV-2.

2) Набор реагентов для определения антител IgG к коронавирусу SARS-Cov-2 (Anti- SARS-Cov-2 ELISA (IgG)), производства Евроиммун Медицинише Лабордиагностика ГмбХ,

Германия (РЗН 2020/10309 от 12.05.2020) (далее - ИФА ЕИ) (инструкция – см. Приложение Е). В

46

качестве антигена в данной тест-системе используется S1 домен S белка коронавируса SARS- CoV-2.

3) Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к

рецептор-связывающему домену поверхностного гликопротеина S (spike) коронавируса SARS- CoV-2 «SARS-CoV-2-RBD-ИФА-Гамалеи» (далее - ИФА Гамалея) (РЗН 2020/10393 2020-05-18,

паспорт к набору представлен в Приложении Ж, инструкция к набору представлена в Приложении З). В качестве антигена в данной тест-системе используется RBD домен S белка коронавируса SARS-CoV-2.

4) Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к

SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-IgG-ИФА-БЕСТ) по ТУ 21.20.23-107-23548172-2020 АО «Вектор-

Бест», Россия (РЗН 2020/10388 от 18.05.2020) (далее - ИФА ВБ), (инструкция – см Приложение И). В качестве антигена в данной тест-системе используется S белок коронавируса SARS-CoV-2.

5) Набор реагентов для выявления иммуноглобулинов класса G к коронавирусу SARS- CoV-2 методом иммуноферментного анализа «SARS-CoV-2 IgG» по ТУ 21.20.23-8660-17253567-

2020 ООО НПФ «Литех», Россия (РЗН 2020/10226 от 30.04.2020) (далее - ИФА Литех),

(инструкция – см Приложение К). В качестве антигена в данной тест-системе используется S2

домен S белка коронавируса SARS-CoV-2.

6)Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к

коронавирусу SARS-CoV-2 «COVID-19 lgG ELISA Kit», производитель Тайчжоу биотехнология Ко., Лтд, Китай (далее - ИФА Тайчжоу), (инструкция – см Приложение Л) В качестве антигена в данной тест-системе используется смесь S и N белков коронавируса SARS-CoV-2.

7)Набор реагентов для иммуноферментного выявления иммуноглобулинов класса G к

коронавирусу SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2 IgG ELISA Kit», производитель Creative-Diagnostics,

США, (далее - ИФА CD) (инструкция – см Приложение М). В качестве антигена в данной тест-

системе используется смесь из всех белков коронавируса SARS-CoV-2.

2.1.3. Оборудование и средства измерения:

-Многоканальный фотометр для иммуноферментного анализа с вертикальным ходом луча сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450/620 нм (SUNRISE TECAN);

-Суховоздушный термостат с температурой (37±1) °С (Sanofi Diagnostics Pasteur);

-Дозаторы переменного объема со сменными наконечниками для внесения жидкостей:

12или 8-канальные 50-300 мкл и 1-канальные 5-1000 мкл («Sartorius AG»);

-Ванночки/лотки для реагентов или чашки Петри диаметром 100 мм (ГОСТ 25336-82);

-Бумага фильтровальная (ГОСТ 12026-76)

47

-Стаканы химические мерные/колбы мерные/цилиндры мерные вместимостью 50-

1000 мл (ГОСТ 1770-74);

-Пробирки/флаконы стеклянные для разведения образцов (ГОСТ 25336-82) или планшет для предварительного разведения образцов.

-Твердотельный термостат «Гном» (ДНК-технология, Россия);

-Иммунохимический анализатор ARCHITECT i1000SR, Эбботт;

-Микроскоп

-Клеточный инкубатор

2.1.Методы

2.1.1. Наработка вируса, определение инфекционного титра и подтверждение

методом ПЦР

Вирус SARS-CoV-2 (hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) был получен из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Накопление вируса проводили в клетках Vero E6 в среде DMEM с 2% инактивированной FBS:

клетки заражали при множественности инфекции MOI=0,01 и инкубировали при 37°С в 5% СО2.

Через 72 часа собирали культуральную жидкость, осаждали клеточный дебрис центрифугированием при 9000g 10 мин +4оС. Культуральную жидкость, содержащую вирус,

аликвотили, замораживали и хранили при -80оС. Титр инфекционного вируса определяли на клетках Vero E6 путем определения 50% инфекционной дозы культуры ткани (TCID50 - tissue culture infectious dose 50). Последовательные 10-кратные разведения исходного материала вируса готовили в DMEM с 2% инактивированной FBS и в объеме 100 мкл добавляли к клеткам Vero E6

в 96-луночном планшете в 8 повторах. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 96

часов и оценивали визуально цитопатический эффект. Титр TCID50 рассчитывали по методу Рида и Менча [9]. Также инфекционный титр определяли методом бляшкообразования.

Последовательные 10-кратные разведения исходного материала вируса готовили в DMEM с 2%

инактивированной FBS и в объеме 100 мкл добавляли к клеткам Vero E6 в 6-луночные планшеты в 3 повторах. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2 в течение 4 часов, далее покрывали раствором 1% агара в среде DMEM с 2% инактивированной FBS, инкубировали при 37°С в 5%

СО2 в течение 72 часа, после чего наносили вторую порцию покрытия с добавлением 10 мкг нейтрального красного на 1 мл покрытия в пересчете на конечный объем. Учет результатов проводили через сутки после внесения нейтрального красного [158].

Для выделения РНК из суспензии вируса использовали Реагент для выделения суммарной РНК ExtractRNA (Евроген), выделение РНК проводили по протоколу фирмы-производителя. Для постановки обратной транскрипции и ПЦР использовали набор реагентов OneTube RT-PCRmix

48

(Евроген, Россия), реакции проводили по протоколу фирмы-производителя. ПЦР проводили в термоциклере Bio-Rad iQ5 в режиме реального времени. Для ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды, специфичные к области RdRp вируса SARS-CoV-2:

RdRp -F 5’-GTGARATGGTCATGTGTGGCGG-3’,

RdRp-R 5’-CARATGTTAAASACACTATTAGCATA-3’,

RdRp-P 5’-FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC- RTQ1-3′. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой Евроген (Россия) [159].

2.1.2. Определение титра вируснейтрализующих антител (ВНА) методом РВН.

Образцы плазмы крови доноров и реконвалесцентов инкубировали при 560С в течение 30

минут в твердотельном термостате «Гном» (ДНК-технология, Россия) с целью инактивации системы комплемента [119].

Реакцию нейтрализации ставили в варианте постоянная доза вируса – разведения плазмы.

Готовили разведения плазмы в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при

37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Конечные разведения плазмы составили 1/20-1/1280. Анализ проводили в трех повторностях. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За титр ВНА исследуемой плазмы принимали высшее ее разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х.

2.1.3. Определение уровня иммуноглобулинов класса G специфичных к SARS-

CoV-2 методом ИФА

Определение антител в реакциях ИФА для полуколичественного определения и расчет коэффициентов позитивности проводили согласно инструкциям производителей.

Количественное определение концентрации специфических антител в исследуемом образце проводили по сравнению со стандартным образцом по калибровочному графику,

построенному в двойных логарифмических координатах по результатам измерения оптической плотности (y – lg оптической плотности СО, х – log2 кратности разведения СО). В качестве калибратора использовали разработанный СО, который титровали в буфере для образцов соответствующего набора реагентов в диапазоне концентраций от 0,4 до 0,006 АКЕ/мл.

Приготовление реагентов

Реагенты, входящие в состав набора реагентов, использовали согласно инструкции по применению Набора реагентов для определения антител к антигену SARS-CoV-2.

Приготовление калибровочных образцов

49

Во флакон с лиофилизированным СОП добавляли 0,1 мл воды очищенной (Исходное разведение СОП) и выдерживали 15 минут, периодически встряхивая. Тщательно перемешивали до полного растворения.

Для анализа разводили СОП до содержания специфических антител 0,4 АКЕ/мл

(Основное разведение СОП) буфером для разведения образцов, входящим в Набор реагентов для определения антител к антигену SARS-CoV-2.

Затем полученное Основное разведение СОП последовательно двукратно разводили буфером для разведения образцов в 2, 4, 8, 16, 32 раза (в итоге получали шесть последовательных разведений СОП, содержащих 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 АКЕ/мл антител против SARS-CoV-

2). Для этого готовили 5 центрифужных пробирок с 0,3 мл буфера для разведения. Далее в первую пробирку к 0,3 мл буфера для разведения добавляли 0,3 мл Основного разведения СОП. Раствор тщательно перемешивали. Далее 0,3 мл полученного раствора переносили в следующую пробирку, также тщательно перемешивая. Процедуру повторяли последовательно для всех пробирок.

Подготовка исследуемых образцов (ИО). Исследуемые образцы разводили буфером для разведения образцов 1:100 (плазма крови человека) или 1:1000 (препараты иммуноглобулинов).

Получали основное разведение ИО.

Затем полученное основное разведение исследуемого образца последовательно двукратно разводили буфером для разведения образцов в 2, 4, 8, 16, 32 раза (в итоге получали Серию последовательных разведений исследуемого образца, состоящую из Основного разведения исследуемого образца и 5 последовательных).

Для этого готовили 5 центрифужных пробирок с 0,3 мл буфера для разведения. Далее в первую пробирку к 0,3 мл буфера для разведения добавляли 0,3 мл Основного разведения ИО.

Раствор тщательно перемешивали. Далее 0,3 мл полученного раствора переносили в следующую пробирку, также тщательно перемешивая. Процедуру повторяли последовательно для всех пробирок.

Подготовка контрольных образцов набора реагентов

Контрольные образцы, входящие в состав Набора реагентов, использовали согласно инструкции по применению набора реагентов для определения антител к антигену SARS-CoV-2.

Постановка анализа

Вносили в соответствующие лунки планшета по 0,1 мл следующие образцы:

-образцы серии последовательных разведений СОП

-контрольные образцы, входящие в состав используемого набора реагентов

-образцы серии последовательных разведений ИО.

50

Постановку ИФА проводили согласно инструкции по применению используемой тест-

системы для определения антител к антигену SARS-CoV-2.

Учет результатов. Результаты ИФА регистрировали с помощью многоканального фотометра для иммуноферментного анализа при длине волны, указанной в инструкции по применению набора реагентов для определения антител к антигену SARS-CoV-2.

Определение уровня антител

Алгоритм расчетов

Рассчитывали среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП) каждого образца серии последовательных разведений СОП по формуле:

ОПср=(ОП1+ОП2)/2

Определение уровня антител против SARS-CoV-2 в исследуемых образцах проводили по калибровочному графику, построенному в координатах:

y – lg ОПср СОП,

х – log2 кратности разведения СОП.

Калибровочный график строили по результатам определения ОПср для шести разведений СОП. Проводили линию тренда.

Выбирали на графике линейную область, состоявшую из пяти разведений СОП. Для выбранного участка проводили линию тренда. При этом на графике появлялись уравнение и R2 .

При правильном выборе линейного участка значение R2 увеличивалось.

Рассчитывали среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП) каждого образца серии последовательных разведений исследуемого образца по формуле:

ОПсрИО=(ОП1ио+ОП2ио)/2

В расчетах использовали только те значения ОПсрИО, которые укладывались в линейную область калибровочной кривой.

По ОПсрИО каждого разведения исследуемого образца находили lg этого числа.

Полученные значения подставляли в уравнение:

х=(lg ОПсрИО-a)/b, где

a– свободный член;

b– угловой коэффициент.

Получали значения Хио.

Вычисляли обратный логарифм полученных значений (А) по формуле: 2х

Вычисляли концентрацию специфических антител в разведениях исследуемого образца по формуле:

Т=(0,2х В)/А,

где