книги / Метан в водных экосистемах
..pdfчих жирных кислот, представленных муравьиной, уксусной, пропионовой, масляной и другими кислотами.
Основными продуктами кислотогенной стадии метаногенеза яв ляются водород, диоксид углерода, этанол, ацетат, пропионат, бу тират. Помимо углеводов, органические вещества сточных вод обычно содержат значительное количество белков и жиров. Белки при метаногенезе гидролизуются в пептиды и аминокислоты, кото рые затем ферментируются в уксусную, пропионовую, масляную, изомасляную, изовалериановую, валериановую, фенилуксусную, фенилпропионовую, бензойную и индолилуксусную кислоты, а также аммиак и сероводород. Глицериды, фосфолипиды и другие жиры гидролизуются с высвобождением жирных кислот с длинной цепью.
3. Ацетогенная стадия, на которой образуются непосредст венные предшественники метана - ацетат, водород, углекислота. Разложение восстановленных органических соединений, продуктов кислотогенной стадии осуществляют облигатные протонвосстанавливающие или облигатно-синтрофные бактерии, как пра вило, нуждающиеся в водородиспользующих партнерах, за что их часто называют синтрофными. Взятые в целом как группа, они в процессе метаногенеза расщепляют спирты и жирные кислоты (ли нейные, изо- и ароматические) с образованием уксусной кислоты, водорода и углекислоты [101].
Удаление водорода, кроме метановых бактерий, могут осущест влять сульфатредукторы, что более выгодно термодинамически. Парциальное давление водорода в метаногенной экосистеме регу лирует не только конечные продукты жизнедеятельности фермента тивных бактерий, но и их последующее расщепление с .помощью ацетогенных бактерий. Таким образом, в метановом биоценозе су ществует тесный симбиоз между ацетогенными бактериями и водородиспользующими метаногенами, определяющую роль в нем игра ет межвидовой перенос водорода. Воздействие массопереноса может менять локальную концентрацию водорода и влиять на кине тику процесса [119].
4. Метаногенная стадия. Сложный процесс распада органиче ского вещества в анаэробных условиях завершают метанобразующие бактерии, или метаногены. Работа этих бактерий начинается только тогда, когда вследствие разрушения органического вещества микроорганизмами предыдущих стадий появляются следующие субстраты: водород, диоксид углерода, закись углерода, формиат, ацетат, метанол и метилированные амины (моно-, ди-, триметиламин).
Наиболее универсальным источником водорода и энергии для метанобразующих бактерий является среда с С02 + Н2:
4Н2 + С02 -» СН4 + 2Н20, AG = -130,4 кДж-моль (25°С; 1 ат) |
(5) |
Ряд метаногенов получают энергию за счет использования формиата [318]:
4НСОО>2Н+-*СН4+С02+2НСОз, AG=-119,5 кДжмоль (25°С;1 ат)(6)
Важным для многих метаногенов является ацетат:
СН2СОО' + 1-Г-> СН4 + С02 , AG = -32,5 кДжмоль (25°С; 1 ат) (7)
Известна способность некоторых метанобразующих бактерий использовать закись углерода:
4СО + 2Н20 — СН4 + 3C02, AG = -185,5 кДж-моль (25°С; 1 ат) (8)
Метанол, как субстрат для метанобразующих бактерий, извес тен давно. Пайн и Вишняк (Pine, Vishniak, 1957) показали, что бро жение метанола с образованием СН4 протекает через реакцию дисмутации, в процессе которой одна молекула утилизируемого суб страта окисляется до муравьиной кислоты, другая - восстанавлива ется до СН4 и Н2. Причем образуемые вещества - муравьиная ки слота и водород - опять включаются в метаболический обмен. Ве роятно, этот процесс можно представить в виде следующих реакций
(уравнения 9, 10, 11), которые в суммарном виде дают уравнение
(12):
С Н з О Н + С Н 3О Н |
-» С Н 4 + Н С О О Н + Н2, |
(9) |
Н С О О Н |
Н 2 + С 0 2, |
( 1 0 ) |
2СНчОН + 2Н, — 2СК. + 2Н,Р.______________ (111 4СН3ОН — ЗСН4 + С02 + 2Н20, AG = -103,0 кДж-моль(12)
Пайн и Вишняк полагают, что пути брожения метанола и уксус ной кислоты до метана очень близки'друг к другу и распад уксусной кислоты идет через стадию эндогенного метанола.
В качестве субстрата для метаногенов используются и метили рованные амины (моно-, ди-, триметиламины) [417]:
4CH3NH2*+2H20+4H+—►3CH4+C02+NH4*, AG=-74,0 кДж моль |
(13) |
2(СН3) 2NН++2Н20+2Н*—►3CH4+C02+2NH4+, AG=-74,0 кДж моль |
(14) |
4(CH3)3N++6H20+4H*—>9CH4+3C02+4NH4+, AG=-74,0 кДж-моль |
(15) |
Таким образом, развитие метанобразующих бактерий зависит от образования этих веществ (Н2, С02, СО, формиат, ацетат, мета нол и метилированные амины) микроорганизмами более высокого трофического уровня, с которыми метаногены вступают в тесные физические и трофические ассоциации. Приведенные в работе [136] материалы показывают, что метанобразующие бактерии являются регуляторами потока электронов при анаэробном разрушении орга нических веществ в природе, они направляют процессы разрушения
органического вещества другими бактериями в сторону большего образования водорода и ацетата. Метаногены, с одной стороны по требляя продукты брожения, влияют на обмен первичных анаэро бов, с другой стороны активность последних положительно влияет на развитие метанобразующих бактерий.
В природных экосистемах возможны весьма различные соотно шения путей бактериального образования метана, зависящие от гидрохимии водоемов, характера энергетического субстрата и каче ственного и количественного состава микрофлоры. Исследования ученых показывают, что в зависимости от условий, создаваемых в водных объектах, относительный вклад субстратов в образование метана может существенно варьировать. Так, в осадках содовых озер метаногены в основном используют водородный и метилотрофный пути метаногенеза [103,121,181 и др.], в противополож ность пресным и морским водоемам, где преимущественно исполь зуется водородный и ацетокластический пути [17,136,145,184 и др.], хотя иногда в морских условиях метилотрофный путь превалирует над ацетокластическим [175]. В гиперсоленых водоемах доминирует метилотрофный путь метаногенеза [419]. В очистных сооружениях при избытке органического вещества метан образуется главным об разом из ацетата [119]. Предпочтительными субстратами для мик рофлоры твердых бытовых отходов были метиламин, ацетат и ме танол [188].
На примере пресных и морских водных объектов выявлено, что процесс образования метана из Н2 + С02 интенсифицируется при удалении от берега и уменьшается от верхнего горизонта осадков к нижнему и, как следствие, в результате изменяется и доля метана, образованного из этого субстрата. Доля метана, образованного из ацетата, наоборот, увеличивается к нижним слоям осадков и падает при удалении от берега [27,53,73,125,140,148,179,180]. Так, напри мер, в глубоководных осадках озера Байкал [180] основными пред шественниками метана являются Н2+ С02, из которых синтезирует ся 97,6-99,9 % метана, тогда как из ацетата - 0,05-1,0 %, из фор миата - 0,05-1,4 %. Обратная картина наблюдается на мелководных станциях, где большая часть метана (24,6-97,9%) образуется из ацетата, а из формиата - 0,4-39,2 % и Н2+ С02- 1,3-22,8 %.
Метаногенные бактерии до 90-95 % используемого углерода превращают в метан, чтобы за счет сопряженного образования трансмембранного потенциала аккумулировать необходимую для конструктивного обмена энергию, и лишь 5-10 % углерода превра щается в биомассу. Благодаря указанной особенности, до 80-90 % органического вещества, разлагающегося в процессе развития ме таногенного консорциума, превращается в газ. Так, при метановом
сбраживании глюкозы по суммарной реакции (С6Н120 6 —►ЗСН4 + ЗС02+ биомасса + тепло) лишь 8 % энергии расходуется на прирост биомассы, 3 % составляют тепловые потери и 89 % переходит в ме тан. Низким выходом энергии в процессе метанового брожения, в частности, объясняется важное свойство микроорганизмов метано вого биоценоза - возможность длительное время (месяцы) обхо диться без субстрата с быстрым восстановлением активности после возобновления питания [119].
Установлено, что ряд метаногенов требует для роста введения в среду таких микроэлементов, как никель (13 мг/л), кобальт, мо либден (0,5 мг/л), селен, вольфрам. Для метаногена Mcc.euhalobius характерным признаком является потребность в высоком содержа нии Са2+ и Мд2* в культуральной жидкости [29]. В отсутствие этих ионов рост Mcc.euhalobius не наблюдается. Развитие организма возможно при концентрации Са2* от 7 до 140 мМ при оптимуме 68 мМ. Ростовой интервал концентраций Мд2* - 1,8-30,0 мМ при опти муме 12 мМ. Проведённые исследования показали, что Са2* оказы вает влияние на ригидность и формообразующую функцию клеточ ной стенки Mcc.euhalobius. Жесткая зависимость выделенного ме таногена от содержания в среде кальция объясняет возможность его существования в пластовых водах рассольного типа с высоким содержанием Са2* Развиваясь в такой среде, организм использует ион кальция для стабилизации клеточной оболочки.
Эксперименты по изучению влияния сульфатов и сероводорода на развитие чистых культур рода Methanobacterium выявили, что HS' в концентрации до 300 мг/л и S042' в концентрации до 1000 мг/л пи тательной среды не угнетают роста культур и скорости образования метана. Важным событием явилось открытие способности метанобразующих бактерий продуцировать некоторое количество H2S путем дессимиляторной сероредукции в присутствии молекулярной серы в качестве акцептора электронов и обычных энергетических субстра тов (Н2или метанол) [399].
Зендер и Брок [415] обнаружили, что некоторые метанобразующие бактерии (M.ruminantium, M.formicium, M.thermoautotrophicum, M.hungatei, M.barkeri) способны одновременно и образовывать, и окислять метан. Количество окисленного СН4 составляет 0,3-0,001 % от образованного. Метан является предшественником метильных групп ацетата, синтезируемого в ходе окисления метана. Механизм и значение этого процесса для самих бактерий пока остается неяс ным.
3.2. Метанобразующие бактерии
Общая характеристика и таксономия метанобразующих бактерий. Исследование процесса образования метана при ана эробном распаде органического вещества было начато ещё в XIX веке. Была доказана биологическая природа этого процесса [192], но выделить чистые культуры метанобразующих бактерий удалось Баркеру лишь после 1936 г. В первых классификационных схемах метанобразующие бактерии относили к различным родам на осно вании морфологических критериев. Баркер впервые в 1956 г. [303], а затем Бриан [310] уникальное физиологическое свойство этих бак терий продуцировать метан поставили выше морфологических осо бенностей.
Фокс и соавторы [331] использовали методику каталогизации олигонуклеотидных последовательностей рибосомальной 16S и рРНК и показали генетическое единство группы метаногенов. Эти данные были подкреплены результатами последующего изучения структуры ДНК, метаболизма и состава липидов, что привело к ре визии классификации метаногенов. Применение хемотаксономических и молекулярно-биологических методов и, прежде всего, иссле дование рРНК, выявило уникальные особенности метаногенов, по зволившие выделить их в особую группу архебактерий.
Метанобразующие бактерии являются высоко специализиро-. ванной группой облигатно-анаэробных микроорганизмов, предста вители которой получают энергию для роста в процессе образова ния метана из ограниченного набора субстратов, включающего Н2+ С02, формиат, ацетат, метанол и метилированные амины (моно-, ди-, триметиламин).
Метанобразующие бактерии представлены видами с разной морфологией. Среди них имеются округлые, ланцетовидные, спи ральные, нитевидные и другие формы. Хотя субмикроскопическая организация клеток метанобразующих бактерий относится к прока риотному типу, в их состав входит ряд уникальных биохимических соединений. Метаногены содержат ряд не встречающихся у других микроорганизмов коэнзимов и хромофорных факторов (коэнзим М, метаноптерин, F420, F43o, Бз« и др.), отличаются составом и структу рой рибосольных (16S и 5S рРНК) и транспортных РНК, составом липидов [91].
Наиболее важны два кофактора - коэнзим М и так называемый F430. Первый кофактор представляет собой 2-меркаптоэтансульфо- новую кислоту, действующую как терминальный переносчик СН3 группы, а второй - комплекс никеля с тетрапиррольным макроцик
лическим лигандом корфином. Этот комплекс катализирует выделе ние метана из метилкоэнзима М (МеСоМ):
CH3SCH2CH2SO3' + 2 ё + 21-Г CH4t + HSCH2CH2S03-, (16)
Корфин - гибрид порфирина и коррина, макроциклического тетрапирольного лиганда, входящего в витамин В12 в виде комплек са с СО. Все метаногены богаты никелем, большая часть которого используется для синтеза фактора F430 и многочисленных Ni - гидрогенаэ, осуществляющих превращение: Н2 2Н* + 2 е. Никель входит также в CO-дегидрогеназу, которая катализирует реакцию:
СО + Н20 -» С02 + Н2 |
(17) |
Обе группы ферментов содержат никель в виде кластеров с желе зом и серой и осуществляют активизацию Н2 и С02для дальнейших химических превращений.
Клеточная стенка метанобразующих бактерий, в отличие от большинства бактерий, не содержит муреиновой кислоты и амино кислоты в D-форме, характеризуется большой вариабельностью и составлена из кислых полисахаридов, белков и псевдомуреина, в котором вместо мурамовой кислоты имеется тапоэаминуроновая кислота. В зависимости от состава клеточной стенки метанобразующие бактерии могут окрашиваться как грамположительные или грамотрицательные. Другое отличие метанобразующих бактерий проявляется в том, что их клеточные мембраны содержат глицери новые эфиры полиизопреноидов. Среди внутриклеточных включе ний этих бактерий следует отметить полифосфаты, присутствующие у метаносарцин, и гликоген, обнаруженный у представителей Methanosarcina, Methanococcus vanielii и Methanospirillum hungatei [405].
Все метанобразующие бактерии являются облигатными ана эробами, для роста которых требуется низкий окислительно восстановительный потенциал. Поэтому в природе они развиваются в основном в экосистемах, лишённых кислорода, а максимумы их численности приходятся на горизонты наиболее восстановленных осадков. Вместе с тем, известны данные о способности некоторых видов метаногенов к образованию метана и после длительного кон такта с кислородом [191,353,397,416]. Обнаружение метаногенов, устойчивых к кислороду, объясняет присутствие жизнеспособных клеток метанобразующих бактерий в природных водах, содержащих Ог и имеющих высокий ОВП (до + 180 мВ).
Данные о влиянии редокс-потенциала среды на жизнедеятель ность не только метаногенных бактерий, но и строго анаэробных микроорганизмов, вообще носят отрывочный характер. Исключение составляют работы [191,295,329]. В результате эксперимента с ис
пользованием штамма Omelyansky [191] было установлено, что при Зх-часовом контакте с кислородом воздуха метаногенез подавляет ся на 10%, при 6-часовом - на 15%, при 24-часовом - на 25%, а пе риод лаг-фазы увеличивается на 2-3 суток. В суспензиях с низкой концентрацией клеток характер влияния кислорода на метаногенез оставался таким же, лишь период лаг-фазы несколько удлинялся:
Исследования метаногенной активности суспензии клеток Methanosarcina barken при различных значениях Eh [329] также по казали, что высокие значения Eh не являются токсичным фактором в окисленной анаэробной среде. В то же время было установлено, что бактерии различаются по толерантности к высоким значениям окислительно-восстановительного потенциала среды, т.е. в природе даже в условиях единой экосистемы существуют метанобразующие организмы с различной чувствительностью к. кислороду. Одно из объяснений терпимости некоторых метаногенов к кислороду, полу ченное в последнее время при работе с Methanobacterium bryantii, заключается в обнаружении у исследованного организма фермента - супероксиддисмутазы, способного инактивировать активные фор мы кислорода [191].
Изучение донных осадков прибрежных районов Японского моря, островов Куба и Янкича (Курильские острова) [175] показало, что при значении Eh +180...-200 мВ встречаются Mh.halophilus и Ms.barkeri. При более низких значениях от +50 до -200 мВ обнару жен Mcc.methylutens. По-видимому, для анаэробных бактерий суще ствует оптимальное значение Eh среды для потребления опреде ленных субстратов. Это, в свою очередь, может являться ключевым фактором для сокращения лаг-периода при переключении метабо лизма с одного субстрата на другой. В.А. Щербакова и соавт. [295] изучили влияние окислительно-восстановительного потенциала среды на процесс метаногенеза, осуществляемый покоящейся куль турой клеток термофильных метанобразующих бактерий Methano sarcina thermophila TS-2 и Methanobacterium thermophilum M. Прове денные эксперименты показали, что образование метана обеими культурами наблюдалось в диапазоне Eh от +100 до -400 мВ, при чем метаносарцина и палочковидный метаноген имеют различные оптимальные для роста редокс-потенциалы среды, что, вероятно, связано с различием редокс-систем, вовлеченных в процесс обра зования метана, и зависит как от самой метаногенной культуры, так и от природы источника углерода и энергии. Длительное отклонение редокс-потенциала среды от оптимального значения как в- сторону окисления, так и в сторону восстановления, не приводило к прекра щению образования метана, а лишь снижало скорость этого про цесса. Авторами сделано предположение, что способность культур
изменять редокс-потенциал среды опредёляется составом редоксцепей, связанных с метаногенезом и сопряженных с генерацией энергии в клетках метанобразующих бактерий.
Интересным является тот факт, что на примере рисовых почв и гидроморфных солончаков [167,193] была обнаружена зависимость относительного состава их углеводородного газа от окислительно восстановительного потенциала почвы. В гидроморфных солонча ках, например, с увеличением Eh от -70 до +170 мВ закономерно уменьшались потоки СН^ и возрастали относительные содержания этана и пропана; при низком значении Eh наблюдалась практически чистая метановая генерация, а при его повышении росли доли эта на и пропана. Эта закономерность, в случае допустимости ее экст раполяции, может служить удовлетворительным объяснением не значительному относительному содержанию С2Н6 и С3Н8 в газовой фазе биокосных систем с восстановительным режимом [167].
Крайними значениями pH, при которых отмечается развитие ме танобразующих бактерий, является pH от 3,0 (кислые болота) до 10,0 (содовые озера) [315,372]. Большинство чистых культур мета нобразующих бактерий развиваются при нейтральном значении pH среды (6,5-7,5). pH около 7,5 оптимальны для роста M.thermoautotrophicum, Methanobrevibacter arboriphilus и M.vacuolata. Щелочной реакции среды (pH 8,0) требуют M.formicicum и M.vannietii [302].
Среди метанобразующих архей группа алкалофильных (т.е. имеющих оптимум роста при рН>8) организмов была обнаружена сравнительно недавно. Бактериальное образование метана в ще лочных условиях при pH выше 9,5 было установлено в содовых озе рах Африки [308,366,420], Северной Америки [372], Центральной Азии [103].
Результаты по радиоизотопии, как и по выделению, согласуются с тем, что в щелочных озерах при pH 9-10 в основном распростра нены метилотрофные и гидрогенотрофные метаногены [181]. Ис следование вторичных анаэробов микробных сообществ аталассофильных водоемов на примере девяти озер Тувы [103] с диапазо ном pH 8-10 и солености от 1 до 20 %о с варьирующим гидрохимиче ским составом показало, что в экстремальных условиях доминируют метилотрофные метаногены и сульфатредукторы - на водороде и лактате.
Ориентирующий эксперимент показал, что при pH во всем диа пазоне солености присутствуют метилотрофные метаногены, обра зовывавшие 60-70 % метана в газовой фазе. При pH 9 образование метана было отмечено только при 5 %о солености. При pH 10 обра зования метана не было обнаружено. Водородили формиатиспользующие метаногены при высокой солености и величине pH не
за
выявлялись даже в условиях подавления ацетогенов и сульфатредукторов, возможных конкурентов за этот субстрат, стрептомицином - ингибитором истинных бактерий. Только в одном случае при pH 9 и 5 % о солености было обнаружено образование метана (25 %) из Нг, что может предполагать в озерах с соответствующими умеренными условиями присутствие водородных метаногенов, либо быть вызва но метилотрофным метаногеном, способным использовать оба суб страта - метанол и водород.
При определении pH-зависимости оказалось, что оптимумы pH на среде с метанолом и триметиламином различаются: для метано ла оптимум pH 9-9,5, тогда как для триметиламина - около 8,5 [121].
С.А. Иларионов и Е.В. Бонч-Осмоловская [116] в своей работе отметили, что образование метана на метаноле метаносарцинами во всех случаях сопровождалось и накоплением ацетата, образуе мого гомоацетатными бактериями. Образующийся ацетат также яв ляется субстратом для некоторых метаногенов, но в силу его мед ленного использования накопление ацетата приводит к подкисле нию среды (снижение pH до 4,5-4,8) и подавлению метаногенеза.
В.А. Вавилин с соавторами [35] также опубликовали данные, в которых отмечается, что при pH 5,2 разложение бытовых отходов прекращается, и объяснили это ингибированием низкими значения ми pH не только стадии метаногенеза, но и гидролиза (непосредст венно или опосредованно). При pH 5,8 успешное осуществление стадии метаногенеза способствует интенсивному гидролизу.
Из литературных источников известно, что метановое брожение может протекать в диапазонах температур от О до 97°С [101,152]. Однако, клетки метаногенов обнаружены и при температуре до 250°С и давлении 265 атмосфер в пробах из гидротермальных ис точников, а активные биогеохимические процессы циклов серы и уг лерода сульфатредукция, метаногенез и метаноокисление - на блюдались в голоценовых осадках эстуариев и открытого моря за северным полярным кругом при температуре придонной воды от +9 до -1,3°С [148].
Известно, что с возрастанием температуры скорость распада органического вещества увеличивается. Оптимальными для разло жения органического вещества являются интервалы температур 3540°С для мезофильного процесса и 50-55°С - для термофильного. Считается, что микрофлора мезофильного режима значительно бо гаче по количеству и разнообразию видов, т.е. образует больше биомассы [205]. Термофильный метаногенез отличается более вы сокой скоростью протекания процесса [139]. Несмотря на это, тем пературный режим влияет только на скорость процесса, а не на ко личественный состав образующихся продуктов. Известна способ-
ность термофильных метаногенов к выживанию в мезофильных ус ловиях [175].
Микробиологические процессы при низкой температуре могут осуществляться двумя путями. Во-первых, сообществом истинных психрофилов (холодолюбивых - греч.), т.е. организмов, не растущих при температуре выше 20°С. Во-вторых, организмами с широким температурным оптимумом, так называемыми психротрофными ор ганизмами [368], сохраняющими активность при низкой температу ре, хотя оптимум их роста лежит выше 20°С.
Психрофильные условия характеризуются сильным замедлени ем стадии метаногенеза, что приводит к накоплению в системе больших количеств ЛЖК, и прежде всего ацетата [127]. Т.Н. Жилина, Г.А. Заварзин [99], ГА. Заварзин и др. [104] выявили, что в психрофильных сообществах активны Н2-использующие гомоацетатные бактерии, а водородные метаногены отсутствуют или подавлены; сток Н2, помимо гомоацетатных бактерий, осуществляют сульфидогены даже в бедных сульфатом местообитаниях [301].
Результаты экспериментов с растущим психроактивным метано генным сообществом показывают, что при температуре ниже 15°С происходит переключение с метаногенеза на ацетогенез из-за того, что водород становится субстратом гомоацетатных бактерий (За варзин, 1995).
В работе [298] приводится график зависимости выхода метана из болот от температуры, допускающий возможность резкого пере лома скорости процесса около 15°С. Регуляция процессов происхо дит не на уровне видов организмов, а на уровне взаимодействия их в сообществе. Сказанное отнюдь не исключает биогенный метаногенез при низкой температуре. Однако он, видимо, идет в результа те накопления активной массы метаногенов и синтрофов, как мед ленно растущих, так и медленно отмирающих при низкой темпера туре.
Другими авторами [127,187,189] также отмечалось, что для осуществления процесса метанобразования в психрофильных ус ловиях необходима температурная адаптация и развитие соответ ствующего микробного сообщества.
А.Н. Ножевникова с соавторами [187,189], исследуя микрофлору осадков иловых чеков Люблинских полей фильтрации г. Москвы, об наружили, что, хотя скорость образования метана микробной попу ляцией осадков сточных вод резко уменьшалась с понижением тем пературы, она оставалась заметной даже при 5°С. Изучение дина мики метанобразования при 25°С и 5°С показало, что при 25°С об разование метана начиналось немедленно, с высокой скоростью, а при 5°С по мере инкубирования скорость метаногенеза несколько