книги / Основы биохимии и молекулярной биологии

и с большинством азотсодержащих органических соединений, в том числе с белками.

Рис. 1. Примеры пуриновых алкалоидов и продуктов их осадительных реакций

Для испытания подлинности пуриновых алкалоидов (кофеин, теофиллин, теобромин) используется мурексидная проба. Она основана на разрушении молекулы пурина при нагревании с окислителем (перекисью водорода, бромной водой, азотной кислотой и др.) и образовании смеси производных аллоксана и его изомера диалуровой кислоты. Взаимодействуя между собой, они образуют метилированные производные аллоксантина, которые под действием избытка раствора аммиака приобретают пурпурно-красное окрашивание. Окраска обусловлена появлением аммонийной соли метилированного производного пурпуровой кислоты. Мурексидная реакция неспецифична, она является общей для всех производных пурина.

41

Химизм мурексидной реакции с кофеином:

аммонийная соль тетраметилпурпуровой кислоты

Исследуемый материал: чай черный или зеленый. Реактивы:

1)5%-ный раствор HCl;

2)раствор йода в йодиде калия (реактив Вагнера – Бушарда: 5 г йода и 10 г йодида калия растворить в 100 мл воды, можно воспользоваться раствором Люголя, который необходимо развести в 2 раза);

3)10%-ный свежеприготовленный раствор танина;

4)1%-ный раствор пикриновой кислоты;

5)30%-ный раствор азотной кислоты;

6)10%-ный раствор аммиака.

Оборудование:

1)штатив с пробирками;

2)пипетки;

3)песчаная баня или спиртовка;

4)фарфоровая чашка для выпаривания.

42

Ход работы 1 г чая поместить в пробирку, залить 10 мл 5%-ного рас-

твора соляной кислоты и кипятить на спиртовке или песчаной бане в течение 5 мин, считая от момента закипания. Слить экстракт с осадка в другую пробирку и остудить.

Для проведения осадительных реакций в три пробирки налить по 1 мл приготовленного экстракта, в первую пробирку добавить 1 мл раствора йода в йодиде калия, во вторую – 1 мл раствора танина, в третью – 1 мл раствора пикриновой кислоты. Отметить цвет образующихся осадков.

Для проведения мурексидной пробы остаток экстракта перелить в фарфоровую чашку, добавить 10 капель азотной кислоты и выпарить на песчаной бане досуха. Остаток смочить 1–2 каплями растворааммиакаиописатьнаблюдаемоеизменениецветаостатка.

Указания к составлению отчета

1.Записать формулы алкалоидов и продуктов их осадительных реакций.

2.Описать химизм мурексидной реакции с кофеином.

3.Отметить наблюдаемые в эксперименте явления.

4.Сделать соответствующие выводы.

Вопросы для самостоятельной работы

кразделу «Антибиотики и алкалоиды»

1.Какие вещества называют антибиотиками?

2.По каким признакам классифицируют антибиотики?

3.На какие группы могут быть разделены антибиотики в зависимости от продуцирующих организмов?

4.Какие микроорганизмы являются наиболее распространенными продуцентами антибиотиков?

5.Какие принципы положены в основу качественного обнаружения антибиотиков?

6.Что такое единица действия антибиотика (ЕД)?

43

7.Назовите наиболее широко применяемые антибиотики. Чем объяснить необходимость поиска новых антибиотиков?

8.Каковы механизмы развития резистентности у бактерий

кантибиотикам?

9.Насколько безопасно лечение антибиотиками? В чем заключаются отрицательные побочные действия антибиотиков?

10.Какие правила необходимо соблюдать при прохождении курса антибиотикотерапии и как можно снизить неблагоприятные побочные эффекты такого лечения?

11.Что такое алкалоиды? Приведите примеры получения и применения алкалоидов.

12.Дайте общую характеристику алкалоидов и укажите их значение.

13.На каких принципах основаны разные классификации алкалоидов?

14.Почему экстракцию алкалоидов проводят водными растворами кислот? Какая функциональная группа алкалоидов участвует в осадительных реакциях?

15.На чем основано качественное определение алкалоидов? Охарактеризуйте типы качественных реакций, используемых для обнаружения алкалоидов.

44

Раздел IV. АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ

Аминокислотами называют бифункциональные производные углеводородов, которые содержат карбоксильную группу -COOH и аминогруппу -NH2. Аминокислоты – органические вещества, которые участвуют в образовании белков, объединяясь в пептидные цепи. Благодаря своей основной функции – функции построения белка – они участвуют во многих жизненно важных функциях организма. Различают заменимые, незаменимые и условно или частично заменимые аминокислоты.

Заменимые аминокислоты производятся организмом самостоятельно из белков, полученных вместе с употребляемой пищей, или из иных аминокислот. Также их можно получить с приемом биологически активных добавок.

Незаменимые аминокислоты – это аминокислоты, которые не могут быть получены в организме человека с помощью биосинтеза, поэтому должныпостояннопоступатьввидепищевых белков.

Условно (частично) заменимые аминокислоты – соединения, которые производятся организмом из других аминокислот. Также это органические вещества, которые необходимы человеку в различных условиях, например в определенные периоды развития. Некоторые из аминокислот считаются незаменимыми в младенческом возрасте, а некоторые – во взрослом, т.е. синтез аминокислот происходит в разном возрасте по-разному.

Аминокислоты способны соединяться между собой связями, которые называются пептидными, при этом образуется полимерная молекула. Если количество аминокислот в ней не превышает 10, то соединение называется пептидом; если от 10 до 40 аминокислот – полипептидом, если более 40 аминокислот – белком. Пептидная связь – это связь между α-карбоксильной группой одной аминокислотыиα-аминогруппойдругойаминокислоты.

Белки – природные высокомолекулярные вещества, состоящие из мономеров – аминокислот. Белок может состоять из одной или нескольких полипептидных цепей. В состав сложных

45

белков кроме полипептидных цепей входят неаминокислотные компоненты. На рис. 2 показано, как из двух аминокислот образуется дипептид с высвобождением одной молекулы воды.

Рис. 2. Образованиепептиднойсвязи

Каждую аминокислоту, входящую в состав полипептидной цепи, называют аминокислотным остатком. Полипептидная цепь имеет определенное направление, поскольку каждый из ее строительных блоков имеет разные концы с амино- и карбоксильной группами.

Условились считать, что полипептидная цепь начинается с N-конца, т.е. с конца, несущего аминогруппу. При изображении последовательности аминокислот в полипептидной цепи начинают с N-концевого остатка. Так, в трипептиде аланин-глицин- триптофан аланин несет концевую аминогруппу, а триптофан концевую карбоксильную группу. Обратите внимание, что триптофан-глицин-аланин – это уже другой трипептид.

Полипептидная цепь состоит из регулярно повторяющихся участков, образующих основную цепь, и вариабельной части, включающей в себя характерные боковые цепи:

46

Исследуемый материал: сыворотка или плазма крови, 1%- ный раствор яичного белка (белок одного куриного яйца растворяют в 20-кратном объеме дистиллированной воды, фильтруют через марлю).

Реактивы:

1)10%-ный раствор NaOH;

2)1%-ный раствор CuSO4;

3)0,1%-ный водный раствор нингидрина;

4)концентрированная азотная кислота;

5)ледяная уксусная кислота;

6)концентрированная серная кислота;

7)5%-ный раствор ацетата свинца.

Оборудование:

1)штатив с пробирками;

2)пипетки;

3)песчаная баня или спиртовка.

Ход работы

1. Биуретовая реакция на пептидную группу

Метод основан на способности пептидных групп образовывать в щелочной среде с ионами Cu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке. В сильнощелочной среде пептидные группы белка переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют с ионом Cu2+, образуя окрашенный биуретовый комплекс (рис. 3). Ковалентные связи этого комплекса образованы за счет енольного гидроксила, а координационные – за счет атомов азота амино- и иминогрупп, имеющих неподеленные электронные пары.

В пробирку вносят 5 капель исследуемого раствора и прибавляют 5 капель 10%-ного раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1%-ного раствора CuSO4, в пробирке появляется синефиолетовое окрашивание.

48

CH2

SH

Рис. 3. Биуретовый комплекс

Нельзя добавлять избыток сульфата меди (II), так как синий осадок гидроксида меди (II) маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Биуретовая реакция положительна с пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. С ди- и трипептидами она неустойчива. Кроме белков биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных групп,

например биурет H2N-CO-NH-CO-N2H.

На основе биуретовой реакции разработаны методы количественного определения белков.

2. Нингидриновая реакция на α-аминогруппу

Метод основан на взаимодействии нингидрина с α-амино- группой аминокислот, пептидов, белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета. В этой реакции α-аминокислоты и пептиды окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию, декарбоксилированию с образованием аммиака, альдегида и СО2. Нингидрин восстанавливается и связывается со второй молекулой нингидрина посредством молекулы аммиака, образуя продукты конденсации,

49

окрашенные в синий, фиолетовый, красный, а в случае пролина в желтыйцвет. Химизмнингидриновойреакции:

К 5 каплям исследуемого раствора приливают 5 капель 0,1%-ного водного раствора нингидрина, нагревают до кипения и через 1–3 мин наблюдают появление окрашивания.

Нингидриновая реакция может быть положительна с некоторыми аминами и амидами кислот.

Нингидриновая реакция может быть использована для количественного определения α-аминокислот.

3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты

Метод основан на способности аминокислот, содержащих ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание. Ксантопротеиновая реакция характерна для фенилаланина, тирозина и триптофана, имеющих ароматическое кольцо.

К 5 каплям исследуемого раствора добавляют 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. Вначале

50