диссертации / 5
.pdfГосударственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии медикобиологического факультета имени академика П.В.Сергеева
________________________________
МАЛКИН ПЕТР АЛЕКСАНДРОВИЧ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ СТРУКТУР НАНОРАЗМЕРОВ
14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Научный руководитель:
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор
Шимановский Николай Львович
Москва - 2014
2
СОДЕРЖАНИЕ
Раздел I. ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………….. 5
Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы
преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клеток-
мишеней……………………………..…………………………………………10
Глава 2.2. Методы модификации лекарственных средств на наноуровне
…………………………………………………………………. . . . . . . . . . . ..20
Глава 2.3. Эволюция топических глюкокортикоидов, применяемых в
дерматологии ……………………………………………………………… . 34
Раздел III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………… 42
Раздел IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава 4.1. Идентификация и изучение свойств специфических «систем узнавания», локализованных на плазматических мембранах фибробластов кожи …………………………………….…………………………………….57
Глава 4.2. Определение молекулярных мишеней апоптотического
действия |
глюкокортикоидов |
на |
фибробласты |
кожи |
|
………………………….62 |
|
|
|
|
|
Глава 4.3. |
Использование |
наноразмерного кортизол-полимерного |
|||
комплекса |
для изучения |
механизмов |
регуляции функциональной |
активности фибробластов кожи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
Раздел V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. . . . . . . . . . . . . 77
ВЫВОДЫ……………………………………………………………… . . …91
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………... . . 92
3
|
|
С П И С О К С О К Р А Щ Е Н И Й |
5'-Н - 5'-нуклеотидаза |
||
11-ДОК – 11-дезоксикортикостерон |
||
АДФ – |
аденозиндифосфат |
|
АКТГ – |
адренокортикотропный гормон |
|
АМФ - |
аденозин 5'-монофосфат |
|
АТ |
- |
антитела |
АТФ - |
аденозин 5'-трифосфат |
|
АЦ - |
|
аденилатциклаза |
АЦС - |
аденилатциклазная система |
|
БАВ - |
биологически активные вещества |
|
БГП – |
t-бутилгидропероксид |
|
ГДФ - |
гуанозин 5'-дифосфат |
|
ГК – |
|
глюкокортикоиды |
ГКР - |
глюкокортикоидный рецептор |
|
ГМФ – |
гуанозинмонофосфат |
|
ГРК - |
гормон-рецепторный комплекс |
|
ГТФ - |
гуанозин 5'-трифосфат |
|
ГЦ – |
|
гуанилатциклаза |
ДАГ – |
диацилглицерин |
|
ДНК - |
дезоксирибонуклеиновая кислота |
|
ИЛ - |
|
интерлейкин |
ИМФ - |
инозинмонофосфат |
|
ИФ3 |
- |
1,4,5-инозитолтрифосфат |
Кд - равновесная константа диссоциации КМ – кальмодулин ЛС - лекарственное средство мРНК - матричная РНК
НР-ГК - наноразмерный кортизол-полимерный комплекс ПВП - поливинилпирролидон ПГ - простагландин ПК – протеинкиназа
ПМ - плазматическая мембрана ПНФ - пуриннуклеозидфосфорилаза
ПФЗ – потенциалчувствительные флуоресцентные зонды ПЭГК - полиэтиленгликоль РНК - рибонуклеиновая кислота
СКК - стволовая кроветворная клетка СТГ – соматотропный гормон
Т3 - трийодтиронин ТМП – трансмембранный потенциал ТФП – трифлуоперазин
ТХУ - трихлоруксусная кислота ФИА - фенилизопропиладенозин
4
ФИФ2 – фосфатидилинозитолдифосфат ФД – фармакодинамика
ФК – фармакокинетика фл – фемтолитры (10-15 литра) Фл – фосфолипиды Фл А2 – фосфолипаза А2 Фл С – фосфолипаза С
ФМА – форболмеристатацетат Фн - неорганический фосфат
ФНО – фактор некроза опухоли альфа цАМФ - аденозин 3',5'-циклический монофосфат
цГМФ – гуанозин-3,5-циклический монофосфатм – митохондриальный трансмембранный потенциал
п – плазматический трансмембранный потенциал [Ca2+]цит – внутриклеточная концентрация ионов кальция Bmax - концентрация участков связывания лиганда DMPX - диметилпропаргилксантин
Gi - ингибирующий ГТФ-связывающий белок Gs - стимулирующий ГТФ-связывающий белок
Gt - трансдуцин
G-белки - ГТФ-связывающие белки TNF- - фактор некроза опухоли-гамма Vкл – объем клетки
___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ |
5 |
|
Раздел I. ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования
В настоящее время топические стероиды активно применяются при лечении различных воспалительных и аллергических заболеваний кожи - атопического,
контактного аллергического дерматитов, псориаза и других дерматозов.
Использование гидрокортизона, первого препаратa в данной группе, в
дерматологической практике выявило недостаточную его эффективность при тяжелых и хронических процессах [Шимановский Н.Л., 2005; Gessi S. еt al.,
2010]. Поиск препаратов, имеющих более выраженный
противовоспалительный эффект привел к созданию галогенизированных
стероидов, вызывающих выраженные системные |
и местные побочные |
эффекты (синдром Кушинга, снижение иммунитета и |
скорости заживления, |
психозоподобные реакции и т.д.). Ранее считали, что противовоспалительный,
противоаллергический, десенсибилизирующий, антитоксический и
иммунодепрессивный эффекты стероидов реализуются через один рецептор и поэтому неотделимы друг от друга [Cidlowski JA. et al., 1998]. Однако использование современных инновационных технологий открывает новые возможности в этом направлении, в частности применение нанотехнологий для разделения фармакологических эффектов глюкокортикоидных препаратов
[Labeur M. et al., 2010]. Заданное изменение свойств лекарственных веществ с
помощью нанотехнологического подхода включает два основных способа
[Шимановский Н.Л. и др., 2010]. Первый подход - синтез лекарственных соединений, имеющих наноразмеры на основе полимерной модификации лекарственных веществ (конъюгация молекулы лекарственного вещества и полимера) [Wang, Y.S., 2002]. Второй - включение лекарственного вещества в состав наноматериалов представленных мицеллами, дендромерами, сферами
(фуллерены) [Boas U. et al., 2004]. Так, конъюгация лекарственного вещества с полиэтиленгликолем или пэгилирование (ПЭГК) увеличивает растворимость лекарственного вещества за счет собственной гидрофильности, увеличивает
___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ |
6 |
|
размер и массу частицы, снижая, таким образом, интенсивность почечной экскреции. ПЭГК уменьшает доступность лекарственного вещества для протеолитических ферментов и антител. Примеры препаратов такого рода,
одобренных FDА: ПЭГ-аспарагиназа (Oncaspar®), предназначенная для лечения острой лимфоцитарного лейкоза и других лимфоидных опухолевых заболеваний; ПЭГ-аденозина деаминаза (Adagen®), для лечения тяжелых комбинированных иммунодефицитов.
В настоящее время ведутся разработки по модификации различных лекарственных веществ с помощью дендримеров. Наиболее интенсивно разрабатываются модификации следующих классов лекарственных веществ:
НПВС, противомикробные и противовирусные препараты, противоопухолевые средства (цитостатики, радионуклиды, фоточувствительные соединения), что объяснимо не только особенностями их физико-химических свойств, но и
эпидемиологической значимостью соответствующих патологий.
Одной из новых возможностей, связанной с получением синтетических
структур глюкокортикоидов наноразмеров (наностероидов), является изучение
молекулярных механизмов ранних, мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени. За последние годы появились серии
публикаций, описывающих быстрые экстрагеномные мембранотропные
эффекты стероидов [Stahn C. et al., 2008; Löwenberg M. et al., 2008; Revollo JR,
Cidlowski JA, 2009]. К ним можно отнести инотропное и вазоконстрикторное действие альдостерона, быстрые нейрональные эффекты прогестерона, ранние эффекты витамина Д3 на уровень кальция и цАМФ в клетках костной ткани.
Получены также сведения об участии |
мембранных рецепторов эстрогенов и |
|
гестагенов в регуляции активности |
мембранносвязанных |
ферментов |
аденилатциклазы, протеинкиназы С, 5'-нуклеотидазы в норме и при опухолевом росте [Dindia L. et al., 2012]. Ранее было показано, что повысить тропность стероидных гормонов к плазматическим мембранам и модифицировать их генотропную активность можно с помощью
___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ |
7 |
|
комплексирования с полимерными материалами, в частности с поливинилпирролидоном [Духанин А.С. и др., 2003]. Комплекс поливинилпирролидон– глюкокортикоид, не проникая в клетку, способен через мембранные структуры усиливать эффекты (пермиссивное действие)
адреномиметиков (изадрина), и свободного глюкокортикоида на модели тимоцитов крыс – повышать уровень цАМФ и цитостатическую активность глюкокортикоидов. Создание комплексов, не проникающих в клетку, но потенцирующих, например, эффекты адреномиметиков и антиаллергических средств может позволить создать новые антиаллергические,
противовоспалительные средства с избирательным типом действия.
Цель исследования
Целью данной работы было определение фармако-биохимических особенностей действия на фибробласты мономерных глюкортикоидов и наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.
В качестве объекта исследования были выбраны фибробласты кожи – клетки-
мишени фармакологического действия глюкокортикоидов, участвующие в воспалительных и аллергических реакциях при дерматозах.
Задачи исследования
1)Разработка экспериментальной модели для изучения геномных и негеномных эффектов глюкокортикоидов с использованием культуры клеток фибробластов.
2)Определение фармако-биохимических маркеров начальных этапов апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами.
3)Сравнительное исследование геномного и негеномного действия глюкокортикоидов на фибробласты с помощью наноразмерного кортизол-полимерного комплекса.
4)Изучение молекулярных механизмов влияния наноразмерного кортизол-
полимерного комплекса на обмен вторичных мессенджеров в культуре фибробластов кожи .
___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ |
8 |
|
Научная новизна
Впервые показано, что ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза,
которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.
Впервые показано, что величина внутриклеточного рН может служить ранним дифференциальным маркером апоптотической и некротической форм гибели фибробластов.
Впервые установлено, что в терапевтической области концентраций кортизол подавляет кальциевый ответ фибробластов на ангиотензин II (АII). В
физиологическом диапазоне концентраций кортизол потенцирует действие АII,
его эффект опосредован взаимодействием с мембранными рецепторами минералкортикоидов.
Практическая значимость
Предложен новый подход для изучения молекулярных механизмов ранних,
мембранотропных эффектов глюкокортикоидов на клетки-мишени,
основанный на использовании наноразмерных глюкокортикоидов.
Применение наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет избирательно регулировать функциональную активность фибробластов на уровне мембранной рецепторной системы, что открывает новые предпосылки дальнейшей эволюции топических глюкокортикоидов, применяемых в дерматологии, с помощью наноразмерного дизайна оригинальных молекулярных комплексов - разделение терапевтического и побочных эффектов гормонотерапии.
Положения выносимые на защиту
___________ ВВЕДЕНИЕ ____________________ |
9 |
|
1. Ранние этапы апоптоза фибробластов, индуцированного глюкокортикоидами, включают изменение внутриклеточного гомеостаза,
которые определяются уменьшением pH цитоплазмы и увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Молекулярными мишенями действия глюкокортикоидов являются Na/H-обменник и Са-каналы плазматических мембран фибробластов.
2. Использование наноразмерного кортизол-полимерного комплекса позволяет разделить геномные и негеномные механизмы регуляции активности клетки-
мишени.
3. Выявлены два типа экстрагеномного влияния глюкокортикоидов на фибробласты: 1) потенцирующее действие ГК на эффект AII, реализуемое через минералкортикоидные рецепторы; 2) антагонистический мембранотропный глюкокортикоидов, выявляемый при использовании фармакологических концентраций стероидов.
Внедрение результатов исследования
Результаты настоящего исследования используются в учебной работе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.Сепгеева РНИМУ им. Н.И.Пирогова г.Москвы.
Апробация
Основные положения диссертации доложены на 7-ой международной научно-
практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», май 2010 г., Астрахань; на совместной научной конференции кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии и НИЛ молекулярной фармакологии РНИМУ им Н.И.Пирогова.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, в том числе
3 работы в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
_________________ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ___________________ |
10 |
Раздел II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 2.1. Молекулярная фармакология глюкокортикоидов: механизмы преобразования гормонального сигнала в биологический ответ клетокмишеней.
Согласно классической «двухступенчатой» модели, рецепторный цикл состоит из нескольких этапов (рис. 1).
Проникновение стероидов в клетку и связывание с внутриклеточными
(цитозольными или ядерными) рецепторами ГК, представляющими минорную фракцию протеинов (10-12 от общего количества клеточного белка) [Vig E et al.,
1994].
Трансформация гормон-рецепторного комплекса в активную форму.
Активация, возможно, осуществляется за счет фосфорилирования in vivo
рецепторного белка с использованием АТФ в качестве субстрата [Tang Y,
DeFranco DB, 1996].
Взаимодействие комплекса "гормон-рецептор" с акцепторными сайтами
вхроматине. После связывания освободившийся рецептор покидает ядро и возвращается в цитоплазму клетки [Голиков П.П., 1988, 2002]. Таким образом,
биологическая роль рецепторов цитоплазмы сводится к захвату, первичной аккумуляции и доставке гормона в ядро.
Биохимические свойства внутриклеточных рецепторов глюкокортикоидов.
Рецепторы глюкокортикоидов (РГ) были первыми рецепторами стероидных гормонов, обнаруженными в различных тканях [Beato M., 1989]; предполагают,
что они имеются в подавляющем большинстве органов и тканей [Розен В.Б., 1985, 1990]. Доказано наличие специфических рецепторов к ГК в коже,
легочной ткани, печени и других органах.
Внутриклеточные рецепторы глюкокортикоидных гормонов представляют собой ядерные факторы транскрипции, которые относятся к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов/тиреоидных гормонов/ретиноидов/витамина Д3. Они состоят из одной полипептидной цепи (рис. 2), содержащей около 700
аминокислотных остатков, в их третичной