7 семестр / Методичка - Химическая кинетика

Очевидно, что уравнение (7.10) является частным случаем уравнения

Таким образом, константа Михаэлиса даже в двухстадийных ферментативных реакциях в общем случае является кинетической, а не равновесной константой (переходя в константу равновесия лишь в случае k-1 >>k2, что, впрочем, часто имеет место в реальных системах). Поэтому при дальнейшем изложении константы kкат и Кm(каж) будут называться в общем случае кинетическими параметрами ферментативных реакций.

Следует отметить, что рассмотренная выше кинетическая схема ферментативных реакций описывает лишь кинетику в гомогенных условиях.

Чаще всего для анализа кинетических схем ферментативного катализа используют метод стационарных концентраций (k2 >> k1).

Применение этого метода к простейшей схеме катализа дает уравнение Михаэлиса–Ментен:

r = rmax [S ]

K M + [S ]

где rmax = k2[E]0 – максимальная скорость реакции (при бесконечно

большой концентрации субстрата), Константа Михаэлиса(КМ) равна концентрации субстрата, при

которой скорость реакции равна половине максимальной скорости. Константа Михаэлиса характеризует специфичность фермента по отношению к субстрату (чем меньше константа, тем больше специфичность). Типичные значения KM – от 10–6 до 10–2 моль∙л–1 (таблица

7.1).

Константу скорости k2, которая характеризует активность фермента,

иногда называют частотой оборотов фермента. Она равна числу молекул

102

субстрата, которые превращаются на активном центре фермента в единицу времени, и может изменяться в пределах от 0.5 до 106 с–1 (таблица 7.1).

Таблица 7.1. Константа Михаэлиса и частота оборотов для некоторых ферментов

Скорость ферментативной реакции зависит от многих факторов: от концентрации субстрата и фермента, температуры, природы фермента, рН среды, наличия различных регуляторных веществ, способных увеличивать или снижать активность ферментов.

Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рисунок 7.1). При низких концентрациях

субстрата скорость прямо пропорциональна его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается медленнее, а при очень высоких концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его концентрации и достигает своего максимального значения (rmax).

При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное

103

насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рисунок 7.1. Зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации субстрата График зависимости активности фермента от концентрации

субстрата описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Леонора Михаэлиса и Мод Леоноры Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций:

где r – скорость ферментативной реакции;

rmax – максимальная скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата;

Kм – константа Михаэлиса, характеризует сродство данного

фермента к тому или иному субстрату.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рисунок 7.2). Эта зависимость носит прямолинейный характер.

104

представляет собой l/rmax (обратная величина максимальной скорости).

Если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на абсциссе отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/Кm(рисунок 7.4). Таким образом, величину Кm можно

вычислить из данных наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от оси абсцисс в области отрицательных значений.

Недостатком метода линеаризации Лайнуивера–Бэрка является то, что наклон прямой определяется в области малых значений переменных, а это значительно снижает точность определения параметров.

Довольно часто для обработки кинетических данных ферментативных реакций используют так называемое уравнение Иди- Хофсти (7.13), которое также легко получить преобразованием уравнения

(7.7):

При графическом построении экспериментальных данных в координатах Иди-Хофсти (рисунок 7.4) полученная прямая линия пересекает ось ординат в точке Vт и имеет тангенс угла наклона, равный —

Кm(каж).

107

Рисунок 7.4. Линеаризация зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в координатах Иди- Хофсти.

Недостатком метода Иди-Хофсти является то, что зависимая переменная r входит в обе координаты и это сильно снижает точность определения Km и rmax.

Существуют и другие методы линеаризации зависимости скорости реакции от концентрации субстрата: метод Хайнса-Вульфа, метод Эйзенталя и Корнищ-Боудена, представленные более подробно в приложении 9.

108

Экспериментальная часть

Материалыи оборудование

1.анализатор pH-метр-иономер-БПК-термооксиметр «ЭКСПЕРТ-

001» с кислородным электродом (датчиком);

2.раствор фермента глюкозооксидазы с концентрацией 0,1г/см3

(0,01г на 100 мкл воды) (или биочувствительный элемент с иммобилизованным ферментом, или бактериями Paraccocus yeei);

3.диализная мембрана;

4.фосфатный буферный раствор рН=6,8;

5.раствор глюкозы 1 моль/дм3 или 0,1 моль/дм3;

6.автоматические пипетки переменного объема;

7.магнитная мешалка с якорем;

8.кювета объемом 5 см3.

Порядоквыполненияработы

1. Для проведения измерений используется кислородный электрод, модифицированный ферментом и анализатор термооксиметр «ЭКСПЕРТ- 001» (ОАО «Эконикс-Эксперт», Москва) подключенный к персональному компьютеру (рисунок 7.5).

109