Molekulyarnaya_biotekhnologia_Glik_B__Pasternak_Dzh

Рис. 9.4.

Хемилюминесцентный метод обнаружения ДНКмишени. Б — биотип, ЩФ — щелочная фосфатаза. А. Связывание биотинилированного зонда с ДНК-мишенью. В. Связывание стрептавидина с биотином. В. Связывание биотинилированной щелочной фосфатазы со стрептавидином. Г. Образование люминесцирующего продукта под действием щелочной фосфатазы.

к 5'-концу каждого праймера. В качестве красителей часто используют флуоресцеин и родамин, которые испускают зеленый и красный свет соответственно. После ПЦРамплификации ДНК-мишени проводят разделение флуоресцеин-ме-ченного праймера и продуктов амплификации, после чего регистрируют включение метки (рис. 9.5), Если ДНКмишень в образце отсутствует, то не будет образовываться и флуоресцирующий продукт.

Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда — «молекулярного маяка» (рис. 9.6). Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5'- концу присоединен флуоресцентный хромофор (флуорофор), а к 3'-концу — нефлуоресцентный хромофор (тушитель), на который передается энергия возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуоресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуются с комплементарной последовательностью ДНКили РНК-мишени, происходит пространственное разделение

Рис. 9.5. Детекция ПЦРпродуктов с помощью флуоресцентного красителя, присоединенного к праймерам (Р1 и Р2),

флуорофора и тушителя, и зонд испускает свет. Температура реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуорофор и тушитель расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо также, чтобы все 15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствующей последовательности ДНКили РНК-мишени.

Геномная дактилоскопия

Метод геномной дактилоскопии (ДНК-типирование) часто используется в судебной медицине для идентификации биологических образцов. С его помощью можно доказать, что подозреваемый действительно совершил преступление, или, напротив, что он невиновен. Для проведе-

Рис. 9.6. Гибридизация зонда — «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью. Одноцепочечная область зонда гибридизуется с комплементарной последовательностью ДНКмишени, его «шпилька» разрушается, флуорофор и тушитель флуоресценции перестают контактировать друг с другом и наблюдается флуоресценция. Это указывает на то, что между зондом и последовательностьюмишенью произошла гибридизация. Из работы

Tyagi, Kramer, Nat. Biotechnol.

14: 303-308, 1996, с

изменениями

чувствителен, чем определение полиморфизма длины тандемных повторов.

Использование полиморфных ДНК-маркеров

Метод «ДНК-отпечатков» может оказаться полезным и при установлении различий между растительными культурами. Один из вариантов этого метода основан на использовании полиморфных ДНК-маркеров для амплификации случайных фрагментов {random amplified polymorphic DNA, RAPD). Для этого берут произвольные праймеры длиной 9—10 нуклеотидов, не содержащие палин-дромных последовательностей и имеющие ОС-содержание 50—80%, и добавляют их по отдельности к препаратам хромосомной ДНК растений. Каждая ПЦР инициируется одним праймером, который должен быть способен связываться с обеими цепями ДНК-мишени. Нуклеотидные последовательности всех олигонуклеотидов известны, но какой из них окажется эффективным инициатором ПЦР, неясно. Если праймер гибридизуется с обеими цепями ДНК-мишени в подходящей ориентации и сайты расположены на расстоянии от 100 до 3000 п. н. друг от друга, то фланкированный ими сегмент ДНК будет амплифицирован, а

полученный фрагмент можно выделить с помощью гель-электрофореза и визуализировать окрашиванием. Число разных фрагментов ДНК, образующихся при амплификации, зависит от праймера и геномной ДНК. Для одних и тех же праймера и ДНК-мишени продукты амплификации будут каждый раз одинаковыми, а замена лишь одного нуклеотида в праймере приведет к полной смене набора получаемых фрагментов. Таким образом, используя один и тот же набор олигонуклеотидных праймеров, можно сравнивать RAPD-«ДНК-отпечатки» разных растительных культур, а следовательно, и сами культуры. Для выявления различий между двумя очень близкими сортами или культурами растений часто приходится использовать несколько произвольных праймеров с известной нуклеотидной последовательностью (рис. 9.8). Как и все другие молекулярные маркеры, RAPD можно применять для характеристики целых геномов, отдельных хромосом или генов.

По сравнению с другими методами идентификации сложных ДНК метод RAPD обладает следующими преимуществами: 1) для всех видов растений можно использовать один и тот же (универсальный) набор олигонуклеотидных праймеров; 2) не нужно создавать геномные биб-

Рис. 9.8. Электрофорез ПЦРамплифицированных фрагментов растительной ДНК в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Для амплификации фрагментов каждой из двух культур использовали три разных произвольных праймера. В случае праймеров А и В характер распределения полос в полиакриламидном геле для культур 1 и 2 совпадает, если же используется праймер Б, то положение полос различается. Таким образом, с помощью праймера Б можно выявлять различия между культурами 1 и 2.

лиотеки, использовать радиоактивные зонды, проводить гибридизацию, т. е. можно легко и быстро охарактеризовать большое количество образцов; 3) процесс можно автоматизировать. Кроме того, для проведения обычной ПЦР необходимо знать нуклеотидную последовательность искомого гена или его фрагмента — мишени для амплификации. В случае же RAPD амплифицируется любой участок генома, содержащий две комплементарные праймеp у последовательности, которые фланкируют сегмент ДНК длиной от 100 до 3000 п. н.

С помощью метода RAPD удалось отличить друг от друга шесть инбредных линий кукурузы и показать, что ПЦР-продукты гибридов кукурузы представляют собой сочетание ПЦР-продуктов родительских инбредных линий. RAPD-маркеры использовали также для скрининга разных штаммов грибов Leptosphaeria maculans, вызывающих заболевание «черная ножка» у крестоцветных. Было установлено различие между невирулентным (не приводящим к развитию болезни) и вирулентным (вызывающим заболевание) штаммами.

Молекулярная диагностика генетических заболеваний

Диагностика специфических наследственных заболеваний человека на генетическом уровне дает ответ на вопрос, входят ли обследуемые индивидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска. ДНК-анализ можно использовать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики серьезных генетических нарушений.

Тесты на уровне ДНК позволяют безошибочно выявлять специфические мутации. Раньше для этого применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты не требуют экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать системы скрининга для всех моногенных заболеваний.

Серповидноклеточная анемия

Серповидно клеточная анемия ~ генетическое заболевание, обусловленное заменой одного нуклеотида в кодоне, который соответствует шестой аминокислоте в ß-цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, гомозиготных по мутантному гену (S/S), эритроциты имеют необычную серповидную форму; это связано с искажением конформации молекулы гемоглобина вследствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Мутантный гемоглобин не может с достаточной эффективностью переносить кислород, и у таких больных развивается тяжелая анемия с прогрессирующим поражением сердца, легких, мозга, суставов и других органов. У индивидов, гетерозиготных по данному гену (A/S) (носителей генетического заболевания), эритроциты имеют нормальную форму, и симптомы заболевания проявляются лишь в экстремальных условиях (на большой высоте над уровнем моря либо при слишком высоких или низких температурах, когда снижается снабжение организма кислородом). Если оба родителя гетерозиготны (имеют генотип A/S), то вероятность того, что их ребенок будет гомозиготным по мутантному гену (S/S) (т. е. будет болен серповидноклеточной анемией), составляет 25%. Ген серповидноклеточной анемии с высокой частотой встречается среди афроамериканцев и их потомков, а также среди латиноамериканцев. В США проводят скрининг для выявления носителей гена серповидноклеточной анемии, которые могут передать этот ген своим потомкам. Рассмотрим один из используемых для этого тестов.

Замена одного нуклеотида в ß-глобиновом гене, приводящая к серповидноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта для рестрицирующей эндонуклеазы CvnI. Этот фермент узнает последовательность CCTNAGG и расщепляет молекулу ДНК между основаниями С и Т (N -любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последовательность имеет вид CCTGAGG, а в гене серповидноклеточной анемии — ССТGTGG. На этом различии основывается ДНК-диагностика данного заболевания (рис. 9.9).

Используя праймеры, фланкирующие сайт Cvn1, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК (рис. 9.9, А), Амплифицированный фрагмент обрабатывают Cvnl, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии Сvn1-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос (рис. 9.9, В), отличный от такового

Рис. 9.9,

Выявление мутантного гена, ответственного за развитие серповидноклеточной анемии, А. ПЦРамплификация участка ß-глобинового гена, содержащего сайты для эндонуклеазы CvnI, один из которых отсутствует в мутантном гене. Б. Рестрикция полученных ПЦРпродуктов с помощью CvnI. Нормальный ген содержит три Cvn I-сайта в сегменте ДНК, фланкируемом прай-м ерам и, а мутантный — два. B. Электрофоретическое разделение фрагментов, полученных при обработке ПЦРамплифицированной р- глобиновой ДНК с помощью Cvnl. АА — гомозиготность по нормальному β- гпоби новому гену, AS — гетерозиготност:ь, SS

— гомозитотность по гену серповидниклеточной анемии.

в отсутствие Cvnl-сайта. Описанным способом можно без труда и достаточно быстро установить генетический статус обследуемого, не проводя при этом процедуру гибридизации,

Метод ПЦР/ЛОЗ

Не все генетические нарушения, приводящие к появлению дефектных генов, сопровождаются утратой или изменением сайтов рестрикции, поэтому для обнаружения однонуклеотидных замен применяют и другие подходы. В одном из них объединены ПЦР и метод, основанный на лигировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ.

Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в 106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена — G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к данному сайту и комплементарных противоположным цепям (рис. 9.10). Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что 3'-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию, находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а 5'- концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примыкающему к 106му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей нормальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНК-лигазы зонды X и Y ковалентно сшиваются. Если же эти зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го нуклеотида, то некомплементарный ему 3'-концевой нуклеотид зонда X не может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды X и Y.

Рис. 9.10. Метод ПЦР/ЛОЗ. Б - биотин; Д

— дитоксигенин; ЩФ - щелочная фосфатаза; СА — стрептавидин.

Можно синтезировать и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и не будет в случае отжига с нормальной мишенью. Таким образом, метод ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсутствие лигирования.

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5'-конец зонда X метят биотипом, а 3'- конец зонда Y — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было.

Располагая двумя парами зондов, можно установить генетический статус любого человека. Например, ДНК гетерозиготных носителей дает положительный ответ с обеими парами зондов, ДНК лиц, обладающих двумя копиями нормального гена, — только с тем набором зондов, который содержит нуклеотид, комплементарный нормальному сайту, и, наконец, ДНК индивидов с двумя измененными копиями гена — только с набором зондов, детектирующим мутантный сайт. Чтобы минимизировать необходимое для анализа количество исходной ДНК, перед гибридизацией участок ДНК-мишени, содержащий тестируемый сайт, амплифицируют с помощью ПЦР,

ПЦР/ЛОЗ является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все его стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день.

Более простым, хотя и менее чувствительным вариантом ПЦР/ЛОЗ является метод лигазной цепной реакции. Тестируемую ДНК смешивают с избытком двух индикаторных зондов, описанных выше, в присутствии термостабильной ДНК-лигазы. Проводят лигирование при 65 °С, затем повышают температуру до 94 °С, чтобы произошла денатурация образовавшихся гибридов зонд—ДНК-мишень, и вновь понижают температуру до 65 °С для гибридизации свободных нелигированных индикаторных ЛОЗ-зондов с ДНКмишенью. Этот цикл повторяют 20 раз. Если индикаторные ЛОЗ-зонды полностью комплементарны ДНК-мишени, то лигирование будет происходить в каждом цикле, и после 20 циклов накопится достаточно продуктов лигирования («сшитых» зондов X и Y) для того, чтобы их можно было обнаружить с помощью электрофореза или ELISA. Если комплементарность неполная, то лигирование не произойдет и никаких продуктов зарегистрировано не будет.

Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦР-праймеров

Колориметрическое генотипирование основано на применении ПЦР-праймеров, меченных различными флуоресцентными красителями. Чтобы различить мутантную ДНК и ДНК дикого типа, проводят ПЦР с двумя разными праймера-ми. Один из них (Р1) комплементарен ДНК дикого типа и на 5'-конце помечен родамином (красный цвет), другой (РЗ) комплементарен мутантной ДНК и на 5'-конце помечен флуо-ресиеином (зеленый цвет) (рис, 9.11). В обоих случаях амплификацию проводят в присутствии третьего, немеченного праймера (Р2), комплементарного противоположной цепи. Поскольку ПЦР может идти только в том случае, когда праймер полностью комплементарен ДНК-мишени, в присутствии в реакционной смеси всех трех праймеров будет амплифицироваться либо ДНК дикого типа, либо мутантная ДНК, либо обе они, в зависимости от ДНК-мишени, играющей роль матрицы. Если индивид гомозиготен по ДНК дикого типа, то после проведения ПЦР и удаления лишних праймеров будет наблюдаться флуоресценция красного цвета, если он гомозиготен по мутантной ДНК — зеленого, а если присутствуют и мутантная ДНК, и ДНК дикого

типа (т. е. индивид гетерозиготен) — желтого. Этот метод можно автоматизировать и адаптировать для любого однонуклеотидного сайта-мишени в любом гене с известной нуклеотидной последовательностью.

Мутации в разных сайтах одного гена

Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним специфическим изменением в гене. В большинстве случаев мутации происхо-

Рис. 9.11.

Обнаружение точковой мутации с

помощью

флуоресцентно меченных ПЦРпраймеров. А. Используя праймеры Р1

иР2, амплифицируют ДНК дикого типа. Мутантная ДНК при помощи данных праймеров не амплифицируется из-за несоответствия ей праймера Р1, 5'-конец праймера Р1 помечен родамином, праймер Р2 немеченый. Б.

Используя праймеры РЗ

иР2, амплифицируют мутантную ДНК; ДНК дикого типа в этом случае не амплифицируется. 5'- конец праймера Р3 помечен флуорес ценном, праймер Р2 немеченый. Знаки «+*> и *— » соответствуют сайту дикого типа и мутантному сайту, В случае генотипов

«+/+». «+/— » и «— /— »

образуются ПЦРпродукты, содержащие только родамин, смесь родамина и флуоресцеина и только флуоресцеин, и соответсгвенно наблюдается Красная, желтая и зеленая флуорес ценция .

дят в разных сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому заболеванию. В качестве примера можно привести ß-талассемию — наследственное заболевание, связанное с утратой активности ß-глобина. У гетерозиготных носителей при этом обычно наблюдается небольшая анемия. Индивиды же, гомозиготные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайтов, для поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и другом лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических сайтов ß- глобинового гена может приводить к ß-талассемии, необходимо провести по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя и весьма дорогостояща.

Поэтому для скрининга мутаций, возникающих в разных сайтах одного гена, была разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении одной реакции. Для этого синтезируют набор специфических 20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен фрагменту гена-мишени, несущему известную мутацию. К 3'-концу каждого зонда присоединен гомополимер poly(dT) длиной

Рис. 9.11.

Выявление мутаций в разных сайтах одного гена. Б — биотин; СА - стрептавидин; ЩФ - щелочная фосфатаза.